分子生物学吕社民转基因生物与基因打靶.ppt

第12章 转基因生物和基因打靶,Transgenic animal and gene targeting,第一节 转基因动物 transgenic animal,概念 :指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。 特点：分子及细胞水平的操作，组织和整体水平的表达。 目的：培育新种，获取人类所需的生物产品，或进行基因功能的研究。,转基因研究大事记 1974年，美国学者Jaenisch应用显微镜注射法把基因导入真核细胞。 1981年，美国科学家将外源基因导入动物胚胎，创立了转基因动物技术。 1982年获得转基因小鼠。 1987年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗斯林研究所诞生。这只转基因母羊的乳汁中可以分泌抗胰蛋白酶。 1989年，意大利学者用精子作为载体，成功地获得了纯系转基因小鼠。,1997年2月，英国罗斯林研究所维尔穆特博士科研组公布体细胞克隆羊“多利”培育成功。 1997年10月，英国罗斯林研究所宣布已克隆出3只携带有人凝血因子基因转染绵羊。 1999年2月，上海遗传研究所宣布转基因试管牛“滔滔”诞生，其体内被检测到带有人的血清白蛋白基因，这项成果被评为当年“中国十大科技进展”之一。 2000年6月22日晚8时整，生物胚胎工程专家张涌教授在西北农林科技大学种羊场顺利接生了一只雌性体细胞克隆山羊阳阳。,谈家桢院士（左）、著名老中医徐蔚霖教授（右）， 曾溢滔院士（中） ，转基因试管牛“滔滔”,思考题,转基因动物的制备应包括那些环节？ 制备转基因动物可能会遇到哪些问题？ 你认为可采用哪些方法去解决？,三、转基因动物建立流程 1、待转移的目的基因的获得与设计 2、动物遗传背景及种系的选择 在进行转基因动物研究时要考虑遗传背景及 种系的问题。,3、常用的细胞 1）受精卵：受精卵基因操作注射假孕动物子宫胚胎个体。 2） 胚胎干细胞：从着床前的动物胚胎中分离多功能胚胎干细胞 基因操作注射入动物囊胚形成嵌合体胚胎嵌合个体。,5、导入基因,显微注射法 ： 用显微注射仪将外源基因直接注射入实验动物受精卵中，利用外源基因整合到DNA中，从而得到转基因动物。 特点：导入速度快，操作简单，对DNA大小无限制，不需要载体，整合效率较高，它可以直接获得纯系。 缺点：需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死,逆转录病毒感染法： 将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNA中去。 特点：用于分裂后的早期胚胎，特别适于禽类的转基因研究。单点单拷贝插入，外源基因的完整性不易被破坏。 精子载体法： 经电穿孔等方法把外源基因导入精子，令其与卵子结合，受精。,6、接受外源基因的个体的产生 1）受精卵：受精卵基因操作注射假孕动物子宫胚胎个体。 2） 胚胎干细胞：从着床前的动物胚胎中分离多功能胚胎干细胞 基因操作注射入动物囊胚形成嵌合体胚胎嵌合个体,5转基因动物模型的建立,建立鼠系,转基因动物中外源DNA的检测,染色体和基因水平：分离基因组DNA，进行斑点杂交，Southern杂交和PCR分析，原位杂交等以评估外源基因的整合情况。 转录水平：Northern杂交，RT-PCR。 蛋白质水平：Western印渍分析。,动物转基因技术面临着一些问题,生产效率低 基因整合效率不高 生产周期长，成本高 转基因动物死亡率高 常出现不育导致转基因难以传代 无法大规模生产,转基因克隆动物,一、转基因克隆技术是转基因技术和动物克隆技术的有机结合。它以转基因细胞为核供体，采用体细胞核移植技术产生转基因克隆动物，实现种质创新。,二、转基因克隆动物技术显示出现的优势： 1、生产效率高 2、周期短，成本低 3、可以决定后代性别,转基因动物的应用 研究不同发育阶段基因组织和功能，细胞发育的潜能性，细胞核与细胞质的相互关系，胚胎发育调控，肿瘤，神经与发育等。 动物新品种的培育 构建医用或食用蛋白的反应器 用于疾病相关的研究及建立疾病的动物模型 可作为器官移植的供体,第二节 转基因植物,概念 :指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类植物。 方法：获取目的基因受体细胞培养将目的基因导入受体细胞（载体直接转化或先转化农杆菌，后者再转化受体细胞）培养转化细胞筛选阳性细胞培植阳性植株转基因植株的鉴定 另外，也有用病毒介导的基因转移，电击法，基因枪法，显微注射，脂质体介导法，多聚物介导法，激光束穿孔法等,转基因植物实际上，可以被看作生物制备器，主要用于： 生产药物蛋白 制备口服疫苗 获得品质更好的中药材 获得新的农作物品种： 抗虫棉花，抗旱小麦等,转基因植物的应用,基因打靶 gene targeting,一、概述：基因打靶是利用DNA同源重组原理，在基因组中的某一特定部位进行定点的基因重组，是研究基因的功能的有效手段。包括基因敲除（gene knock out）和基因敲入（gene knock in）。,同源重组的分子过程 1、两段较长的同源DNA或同源染色体彼此靠拢，在二条相同极性上断裂 2、产生交叉结构 3、在交叉处横断内切，产生4种含有异源双链的重组产物,二、基因敲除的基本程序,1 、构建打靶载体 1）同源序列 2） 打靶载体常含两种筛选标志 neor ：新霉素抗性基因，阳性筛选标志， neor基因插入用于打靶的外源DNA中，当重组后，细胞能在含新霉素的培养基中生长。,neor,HSV-tk,HSV-tk：单纯疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶基因，阴性筛选标志， 该基因产物可分解单核苷酸类似物而生成毒性产物，产生自杀效果。 HSV-tk基因插入外源基因外侧的载体序列中。同源重组时，Tk-基因往往丢失；随机整合时， Tk-基因连同打靶载体整合到核基因组上，而同时获得neo和HSV-tk两个基因的打靶细胞。,2、 将载体导入ES细胞 选取发育第4-5天的胚胎干细胞(ES) 。 把外来基因转入胚胎肝细胞。 并筛选打靶成功的细胞。,随机整合,同源重组,3 、将基因敲除ES细胞注射入胚泡，形成嵌合胚胎。 4 、将10-20个胚泡植入假孕小鼠子宫。 5 、获得子代小鼠，筛选带有靶基因的小鼠。常有的方法有：Southern印记、Northern印记,把胚胎注入假孕小鼠,Southern印记,把细胞注入胚泡,6、杂和小鼠（+/-）间杂交，获得子二代小鼠（+/+、-/-、+/-）。 7、筛选的-/-、+/-子二代小鼠。,（+/-）,（+/-）,（+/-）,（-/-）,（+/+）,（+/-）,（+/-）,（+/-）,（+/-）,（+/+）,（-/-）,三 、基因打靶在医学中的应用,1、采用基因打靶技术可建立基因缺陷型的疾病模型，用于研究遗传疾病发生的分子机制。 2、基因打靶与肿瘤的研究 研究基因改变与肿瘤发生及治疗的关系 3、基因打靶可用于构建高效的动物反应器或植物反应器，用于药物生产。,小结,转基因技术是在基因重组基础上建立新的多细胞真核生物的方法。这是一个具有重大意义的革命性的突破。它为我们培育新的物种提供了新的思路，为我们研究基因的功能，研究疾病发生的机理提供了有力的