含SARSCoVRNA病毒样颗粒的构建和表达.doc

含SARS CoV RNA病毒样颗粒的构建和表达 作者：李振勇，景建洲，刘明霞，邵大晓，冯艳铭，李智涛，宋国英，王秋旗，王云龙，屈凌波，赵玉芬 【关键词】 病毒样颗粒 【Abstract】 AIM: To construct and express RNaseresistant viruslike particles containing the RNA fragments of SARS CoV. METHODS: The primers of MS2 assembly protein gene, coat protein gene and the fragment of SARS Cov RNA polymerase gene were synthesized according to their sequences from Genbank data and were used to amplify their cDNAs by RTPCR. These cDNAs were purified with SABCs ResincolumTM system for DNA purification from agarose gel. Expression vector pTrc99a and their cDNA fragments were ligated together with T4 DNA ligase after digestion with restriction enzymes. The prokaryotic expression was obtained by the transformation of the recombinant plasmid constructed above into E.coli JM109. The obtained viruslike particles were purified and tested by quantitative analysis, RTPCR and stable experiment. RESULTS: The RNaseresistant viruslike particles containing the RNA fragments of SARS CoV was successfully constructed and remained stable for 30 days at 37. CONCLUSION: The newtype viruslike particles can be conveniently used as positive control of SARS clinical nucleic diagnostic reagents. 【Keywords】 SARS; reverse transcriptase polymerase chain reaction; RNA, viruslike particles; ribonucleases 【摘要】 目的： 构建并表达含有SARS冠状病毒RNA片断的抗核糖核酸酶的病毒样颗粒. 方法： 通过克隆大肠杆菌噬菌体MS2的装配蛋白和壳蛋白基因以及SARS冠状病毒RNA聚合酶基因片段，将这些基因连接到载体 pTrc99a上表达，并进行纯化、定量分析、RTPCR检测和稳定性试验. 结果： 获得病毒样核蛋白颗粒，在37稳定性可达到30 d，能抵抗核糖核酸酶降解. 结论： 该病毒样核蛋白颗粒稳定、安全、可靠，可作为SARS冠状病毒RTPCR检测、定量分析的有效阳性参考品. 【关键词】 SARS； 逆转录聚合酶链反应； RNA，病毒样颗粒； 核糖核酸酶类 0引言 200211/200306 SARS1,2在全球流行，对全球尤其我国的经济发展带来了巨大影响，但在科技人员的努力下，很快研制成功了快速、准确的SARS病毒基因检测试剂. 临床检测中人们普遍关心的是检测试剂盒中使用的阳性参考品是否具有传染性、或者能否起到阳性全程参比的作用. 因此，研制稳定、无传染性的阳性参考品尤为重要. 我们根据Drosten & Collahan等3,4报道的方法，制备了含有SARS冠状病毒RNA聚合酶基因片段的抗核糖核酸酶病毒样核蛋白颗粒. 该病毒样颗粒能有效抵抗RNase引起的RNA降解，能作为SARS冠状病毒基因检测的阳性参考品，对SARS基因检测起到有效的全程监控作用. 1材料和方法 1.1材料 灭活的SARS冠状病毒样本由Robert Koch Institut（德国）提供，MS2噬菌体（ATCC 15597B1）购于美国ATCC; 试剂： MLV反转录酶（Promega）,dNTP (Pharmacia), Taq DNA 聚合酶（华美生物工程公司）,引物和荧光探针（上海生工公司合成）,其他化学试剂均为国产或进口分析纯试剂; RNA提取试剂由华美生物工程公司提供; SARS荧光PCR定量检测试剂盒由华美生物工程公司提供. 扩增仪器用美国PE公司的PE7700荧光扩增仪. 1.2方法 1.2.1基因合成根据Genbank数据库中的基因序列，设计合成大肠杆菌噬菌体MS2装配蛋白和壳蛋白基因引物： MSUP（5atgaattctcctgctcaacttcctgtcg3）与MSDOWN（5gcaagcttgttagtagatgccggagttt3）；SARS冠状病毒RNA聚合酶基因引物SARSUP（5tcaagcttcgcaagtattaagtgagatggtc3）与SARSDOWN（5tcaagcttaagcagttgtagcatcaccg3）. 用异硫氰酸胍方法提取靶RNA，悬浮在反转录反应液中，其中含有100 U的MLV反转录酶、50 U RNA酶抑制剂、1反转录缓冲液、N6随机引物，37孵育60 min. PCR反应体系中含有20 pmol引物、1.5 mmol/L MgCl2, 200 mol/L dNTP和3 U Taq DNA 聚合酶，10 L反转录产物，反应参数是94预变性5 min, 然后94 1 min，55 1 min，72 3 min,进行35个循环，最后在72延伸5 min5. 1.2.2cDNA纯化用PCR产物纯化试剂盒，并将cDNA悬浮在TE缓冲液中备用. 1.2.3cDNA片段克隆表达将表达载体pTrc99a（Pharmacia）和MS2的cDNA片段用EcoR/Hind双酶切，SARS的cDNA片段用Hind单酶切. 消化反应体系中含有10 U的EcoR, 10 U的Hind, 1内切酶缓冲液，37孵育60 min. 连接反应体系包括1 U的T4 DNA连接酶、基因片段、1连接缓冲液，12孵育2 h. 按照CaCl2方法将重组质粒转化到E.coliJM109中，并筛选重组子. 1.2.4病毒样核蛋白颗粒的纯化将重组子接种到100 mL LB（10 g/L 蛋白胨，5 g/L酵母抽提物，5 g/L NaCl，接种前加入氨苄青霉素至终浓度为0.1 g/L）培养基中，37培养过夜，然后转接入1 L培养基中，培养到A为0.5时，加入IPTG至0.4 mmol/L，继续培养5 h，离心收集菌体. 将菌体悬浮在TE（10 mmol/L TrisHCl, 5 mmol/L EDTA, pH 7.5）缓冲液中，加入溶菌酶至10 mg/L，室温放置20 min，匀浆、离心去除沉淀. 上清液分别加入RNase和DNase至终浓度1 mg /L，37温育30 min后，45 400 g离心2 h，然后按照分子克隆试验指南(美J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis,科学出版社,1992:136)方法进行超速离心纯化，悬浮颗粒在SM缓冲液中4储存. 1.2.5病毒样核蛋白颗粒悬浮液定量分析对病毒样核蛋白颗粒悬浮液进行105, 106, 107, 108倍稀释，然后分别以各个稀释度为模板，用SARS冠状病毒荧光RTPCR检测试剂盒在PE7700上进行检测，按照说明书进行定量分析，确定其悬浮液的浓度. 1.2.6病毒样核蛋白颗粒的稳定性试验选取108倍的核蛋白颗粒稀释液，将其在37放置5, 10, 15, 20, 25和30 d，进行加速破坏试验，用SARS冠状病毒荧光RTPCR检测试剂盒在PE7700上进行检测. 1.2.7RNase攻击试验将病毒样核蛋白颗粒悬浮液分别稀释105, 106, 107, 108倍，每个稀释度分别取50 L分两组作为进行RTPCR反应的样品，其中一组作为对照，直接进行样品处理、反转录和PCR扩增，另外一组在样品处理前加入1 mg/L的RNase，室温下放置60 min后，再进行样品处理、反转录和PCR扩增，比较两组的检测结果. 2结果 2.1MS2和SARS基因片段的扩增通过RTPCR扩增，分别获得了1704 bp的MS2基因片段和257 bp的SARS基因片段，其中SARS基因片段克隆在pGEMT载体上，并进行了序列分析，结果证明基因片段与Genbank中发表的BJ01株序列一致. 2.2病毒样核蛋白颗粒的构建和悬浮液的制备分析 2.2.1重组质粒的构建MS2基因片段与表达载体pTrc99a分别通过EcoR和HindI双酶切消化、连接、转化后获得pTrMS重组载体；然后将pTrMS载体和SARS基因片段分别经过Hind内切酶消化、连接、转化后获得pTrMSCoV重组表达载体(Fig 1). 2.2.2重组子的表达、分析经过5 L发酵和纯化，获得了10 mL病毒样核蛋白颗粒悬浮液. 将其进行105, 106, 107, 108倍稀释，分别作为RTPCR反应的模板，其中一组不经过反转录直接进行PCR扩增，检测结果均为阴性（Fig 2第912泳道），表明制备的核蛋白颗粒悬浮液中，没有DNA模板污染，且核蛋白颗粒内也没有DNA模板；另外一组样本首先经过反转录后，再进行PCR扩增，检测结果呈阳性（Fig 2第47泳道），表明SARS基因片段已经重组于病毒样核蛋白颗粒中，而且模板以RNA形式存在. 2.3定量分析以病毒样核蛋白颗粒悬浮液的不同稀释度105, 106, 107, 108为模板，用SARS荧光定量PCR试剂盒（该试剂盒定量标准采用WHO推荐的德国Robert Koch Institut实验室提供的定量灭火病毒）在PE7700扩增仪上进行了荧光定量检测，并根据试剂盒检测曲线、标准曲线、Ct值（Fig 3），按照说明书计算出不同稀释度的起始模板数量，即不同稀释度病毒样核蛋白颗粒悬浮液的浓度分别为： 2.31011, 1.61010, 2.1109, 1.3108 copise/L，根据该实验结果，计算出原始病毒样核蛋白颗粒悬浮液的浓度为1.81016 copise/L. 2.4病毒样核蛋白颗粒的稳定性用正常人血浆将病毒样核蛋白颗粒悬浮液稀释108倍即1.8108 copise/L，在37放置5, 10, 15, 20, 25, 和30 d后，用SARS冠状病毒荧光RTPCR检测试剂盒在PE7700上进行检测，结果表明，制备的病毒样核蛋白颗粒能够抵抗核糖核酸酶等因素引起的RNA降解，在37条件下于正常人血浆中至少可以储存30 d(Fig 4). 2.5RNase攻击试验用RNase处理病毒样核蛋白颗粒悬浮液后，再与对照组平行进行RTPCR检测，两组检测结果一致，表明制备的病毒样核蛋白颗粒能够抵抗RNase的降解. 表1RNase攻击（略） 3讨论 以RTPCR为基础的SARS冠状病毒基因检测方法在“防SARS”中起到了重要的作用. 但是，其检测采用的阳性参考品大多采用体外转录制备的重组RNA，很容易受到RNase、高温、二价离子等因素的影响而降解，储存条件受到很大限制；也不能将重组RNA放入临床检测样本相同的阴性血浆、漱口液等体液中参与完整的实际监测，这将对检测造成很大影响. 采用灭活病毒可以克服这些问题，但具有很大的危害. 近年来，有文献报道用原核表达技术研究病毒外壳蛋白的表达及其体外自组装，证明可以将特定的RNA包装到病毒包膜内构成病毒样核蛋白颗粒7-9. 我们通过设计、克隆和表达，在国内外首次构建了含SARS基因片段的抗核糖核酸酶降解的病毒样核蛋白颗粒. 构建该RNA病毒样核蛋白颗粒的意义在于： 由于该颗粒具有抵抗RNase的特点，作为RNA 病毒RTPCR检测的标准品和质控品具有很好的稳定性. 本研究的结果表明，表达产物在37条件下于正常人血浆中至少可以储存30 d，解决了RNA质控品的邮寄和使用的稳定性问题; 由于表达产物为噬菌体样颗粒，具有很好的病毒颗粒模拟功能. 因此，在核酸提取过程中，与标本中真正病毒核酸的提取过程有很好的相似性，能够在检测过程中真正做到从样品处理到扩增的全程监测，达到质控的目的; 使用原病毒颗粒作为质控品具有潜在传染危险性，采用本研究方法制备的质控品可避免这个问题. 【参考文献】 1WalkerPeach CR, Winkler M, DuBois DB, et al. Ribonucleaseresistant RNA controls (Armored RNA) for reverse transcriptionPCR, branched DNA, and genotyping assays for hepatitis C virusJ. Clin Chem, 1999; 45: 2079-2085. 2 Neumann G, Watanabe T, Kawaoka Y. Plasmiddriven formation of influenza viruslike particles J. J Virol, 2000; 74(1):547-551. 3Drosten C, Seifried E, Roth WK, et al. TaqMan 5Nuclease human immunodeficiency virus type 1 PCR assay with phagepackaged competitive internal control for highthroughput blood donor screening J. J Clin Microbiol, 2001; 39: 4302-4308. 4Callahan JD, Wu SJ, DionSchultz A, et al. Development and evaluation of serotype and groupspecific fluorogenic reverse transcriptase PCR (TaqMan) assays for Dengue virusJ. J Clin Microbiol, 2001; 39: 4119-4124. 5Lochridge VP, Hardy ME. Snow Mountain virus genome sequence and viruslike particle assembly J. Virus Genes, 2003; 26:71-82.