外周血MUC1基因表达与食管癌微转移的关系.doc

外周血MUC1基因表达与食管癌微转移的关系 作者：施舜缤，俞力超，胡嘉波，朱孝中，许文荣【关键词】 食管癌; 黏蛋白; 微转移; 逆转录聚合酶链反应1 资料与方法 1.1 病 例 无转移组:选择2006年1月至2006年5月我院病理确诊为食管鳞癌而经B超、CT或术中探查未发现有远处转移的患者53例。转移组:同一时期病理确诊为食管鳞癌，又经B超、CT或术中探查明确发现有远处转移的患者10例。良性对照组:同一时期的食管炎7 例,贲门失弛症2例,食管烧伤1例。 1.2 标本采集和处理 无转移组、对照组所有患者于采集标本前均未行任何针对肿瘤的治疗,采外周血(采集标本均需肝素抗凝),先抽出1 ml弃去,再留取5 ml。红细胞裂解液裂解红细胞， 分离有核细胞，液氮速冻后，-80保存备用。 1.3 方 法 采用Trizol试剂提取细胞总RNA, 所提RNA经1琼脂糖电泳鉴定。以1 g为模板,以OligodT作引物,置于70温浴5 min后,冰浴2 min,再加入逆转录酶、dNTP等,在42温浴1.5 h合成cDNA, 94灭活逆转录酶及预变性5 min，以cDNA为模板进行PCR 扩增。MUC1基因引物设计序列如下2,3(外引物A和B,内引物C和D,产物分别为510 bp，287 bp) A:5ATGCCAGTAGCACTCACCATAG3；B:5CAGCCAAGGCAATGAGATAGAC3;C:5CGTCGTGGACATTGATGGTACC3；D: 5GGTACCTCCTCTCACCTCCTCCAA3。肌动蛋白作为内对照标准,引物序列E:5TCATCACCATTGGCAATGAG3；F:5CACTGTGTTGGCGTACAGGT3，产物为154 bp。引物均由上海生工生物工程技术服务公司合成。巢式RTPCR扩增条件：第1次，94 90 s后,94 15 s，55 30 s，68 45 s 循环35次；68终延伸5 min，扩增产物510 bp。第2次，94预变性90 s，94 15 s，55 30 s，72 30 s，循环30次；72终延伸2 min。配制1.8%琼脂糖凝胶,产物电泳,经溴化乙啶(EB) 显色得到特异性条带者为阳性检出。 1.4 统计学分析 应用SPSS11.0软件进行统计分析，采用2检验, P<0.05为有差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 总RNA鉴定 经过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,18 S和28 S条带清晰可见，见图1。2.2 各组之间阳性率比较 以肌动蛋白的RTPCR扩增产物量为依据，调整巢式RTPCR 模板量，标本MUC1表达结果见图2。良性对照组10例外周血中无MUC1 mRNA阳性表达。无转移组MUC1 mRNA 阳性检出率为39.6%(21/53),转移组MUC1 mRNA阳性检出率90.0%(9/10),结果见表1，各组间差异有统计学意义(2=6.66, P<0.01)。表1 患者术前外周血MUC1 mRNA的检测结果（略） 2.3 无转移组阳性分布与病理分化程度的关系 不同病理分化程度之间的MUC1 mRNA阳性检出率差异无统计学意义(P>0.05)。结果见表2。表2 无转移组术前外周血中MUC1 mRNA检测阳性分布与病理分化程度的关系（略）2.4 食管癌患者阳性表达与国际TNM分期的关系 MUC1 mRNA阳性率随TNM分期升高而升高。但，期之间相比检出率差异无统计学意义(P>0.05)；而期与，期相比阳性检出率差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。3 讨 论 肿瘤微转移一般指恶性肿瘤细胞播散于淋巴结、骨髓、外周血及其他组织器官中，尚未形成转移性结节,无任何临床表现，常规方法难以发现和检测到的转移4，5 。肿瘤临床转移一般都由微转移发展而来，对肿瘤微转移的检测是临床判断治疗效果、预示肿瘤复发的有效手段。有关食管癌的微转移研究起步较晚,一般局限于食管癌淋巴结的微转移方面6，7。外周血液的微转移研究较少，有证据表明食管癌患者外周血循环中也存在肿瘤细胞，提示食管癌患者并非中晚期才发生血性转移8，9。早期发现肿瘤微转移对肿瘤的分期、复发、预后有重要的意义。表3 食管癌患者术前外周血中MUC1 mRNA检测阳性分布与国际TNM分期的关系（略） 常规RTPCR技术一般1 ml全血中含有100个肿瘤细胞以上时才可能被检测出。采用巢式RTPCR 技术,即用两对引物进行两轮RTPCR扩增,第2对引物序列在第1对引物扩增的RTPCR 产物片段内,那么灵敏度可提高到1 ml全血中含有1个肿瘤细胞就能被检测出10。我们应用巢式RTPCR技术检测了53例食管癌患者术前外周血标本,发现MUC1 mRNA阳性率为39.6%(21/53)，已经发生临床转移的食管癌患者阳性率为90.0%(9/10)；不同病理分化程度之间阳性检出率无统计学意义，可能与病例数较少有关；MUC1 mRNA阳性率随TNM分期升高而升高，期与，期相比阳性检出率有差异有统计学意义(P<0.05)。阳性率与生存率之间的关系正在随访之中。而良性对照组无一例MUC1 mRNA阳性,提示该方法具有较高的特异性。Kimura等11的研究表明,血液中微转移食管癌肿瘤细胞的出现是一个独立预后因素，检测微转移肿瘤细胞具有重要意义。外周血液标本较易获得,可反复取样,动态观察。但应该考虑到外周血采血时间、部位、血量、时间间隔等对检测结果有一定影响。微转移肿瘤细胞进入血液的释放规律、阳性检出率与肿瘤转移及复发的相关性还有待于进一步研究和探讨。【参考文献】 1Yoshioka S,Fujiwara Y,Sugita Y,et al.Realtime rapid reverse transcriptasepolymerase chain reaction for intraoperative diagnosis of lymph node micrometastasis: clinical application for cervical lymph node dissection in esophageal cancersJ.Surgery,2002,132(1):34-40.2Lancaster CA, Peat N, Duhig T, et al.Structure and expression of the human polymorphic epithelial mucin gene: an expressed VNTR unitJ.Biochem Biophys Res Commun,1990,173(3):1019-1029.3Nakajimalijima S, Hamada H, Reddy P, et al.Molecular structure of the human cytoplasmic betaactin gene: interspecies homology of sequences in the intransJ.Proc Natl Acad Sci USA, 1985,82(18):6133-6137.4Raj GV,Moteno JG, Gomella LG.Utilization of polymerase chain reaction technology in the detection of solid tumorsJ.Cancer, 1998, 82(8): 1419-1442.5宋 萍,李 坚,殷凯生.检测外周血Lunx mRNA表达用于诊断肺癌微转移的临床价值J.江苏大学学报:医学版,2006,16(4):304-306.6何金涛,朱江,李强.食管癌淋巴结微转移检查J.现代预防医学，2008,35(11):2176-2177.7Zingg U,Montani M, Busch M,et al.Prognostic influence of immunohistochemically detected lymph node micrometastasis and histological subtype in pN0 oesophageal cancerJ.Eur J Surg Oncol，2009,35(6):593-599.8Liu Z, Jiang M, Yan F, et al.Multipoint quantification of multimarket genes in peripheral blood and micrometastasis characteristic in perioperative esophageal cancer patientsJ.Cancer Lett，2008,261(1):46-54.9Liu Z, Jiang M, Zhao J, et al.Circulating tumor cells in perioperative esophageal cancer patients: quantitative assay system and potential clinical utilityJ.Clin Cancer Res,2007,13(10):2992-2997.10Reiter W, Stieber P, Reuter C, et al.Multivariate analysis of the prognostic value of CEA and CA199 s