外周血单个核细胞HBV的复制状态与干扰素γ表达和分泌的关系.doc

外周血单个核细胞HBV的复制状态与干扰素-表达和分泌的关系 作者：陈天艳，陈瑞琳，蔺淑梅，叶峰，张曦，陈云茹，赵英仁，张树林 【摘要】 目的: 研究HBV侵犯外周血单个核细胞（PBMC）及对IFN-表达和分泌的影响. 方法: 慢性HBV感染者60例，巢式PCR检测PBMC中HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）；ELISA法检测血清IFN-水平；实时定量RT-PCR方法检测PBMC中IFN-mRNA的表达水平. 结果: 48.3%（29/60）的患者PBMC中检测到cccDNA；血清IFN-水平低于对照组（P0.05）；PBMC中IFN-mRNA表达水平低于对照组（P0.01）；PBMC中cccDNA阳性组IFN-表达和分泌水平低于cccDNA阴性组（P0.01）. 结论：HBV慢性感染者PBMC中IFN-表达和分泌水平降低. 【关键词】 肝炎病毒 乙型 DNA 环状 外周血单个核细胞 干扰素型【Abstract】AIM: To study how HBV affect the expression and secretion of IFN- in PBMC. METHODS: sitty patients with chronic hepatitis B were studied. HBV cccDNA in PBMC were amplified by nest-PCR. The level of IFN- in the serum was determined by ELISA. The expression of IFN- mRNA in PBMC was determined by real-time RT-PCR. RESULTS: HBV cccDNA in PBMC were determined by 48.3%（29/60）in patients. The serum level of IFN- in the patients was lower than that in control group(P0.05). The expression of IFN- in PBMC wsa lower in the patients than in control group(P0.01). The expression and secretion of IFN- were lower in cccDNA positive group than in cccDNA negative group（P0.01）. CONCLUSION: The expression and secretion of IFN- in patients with chronic hepatitis B are decreased.【Keywords】 hepatitis B virus; DNA,circular; peripheral blood monocytes; interferon type0 引言 HBV感染慢性化是机体免疫功能紊乱，主要是细胞免疫功能低下所致，Th1/Th2细胞亚群的失衡与HBV持续感染密切相关. IFN-主要由活化的Th1细胞和NK细胞产生，可通过多种途径直接或间接促进Th1应答，提高细胞毒性T细胞（CTL），自然杀伤细胞（NK），单核-巨噬细胞活性，在清除HBV感染的细胞免疫反应中发挥着重要作用. IFN-活性水平直接反映了Th1细胞的功能，与HBV感染后的最终结局密切相关. 因此，在证实HBV侵犯PBMC基础上，我们进一步比较慢性HBV感染者PBMC中cccDNA阳性和阴性组IFN-表达和分泌水平，以了解HBV侵犯PBMC并在其中复制对免疫细胞功能的影响.1 材料和方法1.1 材料 2007-01/2007-05慢性HBV感染者60(男43，女17)例，年龄1552（平均34.7）岁. 诊断标准符合2000年制定的病毒性肝炎防治方案标准. 所有患者均排除HAV，HCV，HDV，HEV，柯萨奇病毒等感染和药物、酒精等其他原因造成的肝脏损害. 健康对照者30例，均来自西安市健康献血员. 无菌采集未抗凝静脉血2 mL,-4离心后立即分离血清，-20冻存；肝素抗凝静脉血10 mL，常规密度梯度法分离淋巴细胞，洗涤细胞5次，分别收集第5次洗液和细胞. 将细胞分2份，一份-70保存，用于检测乙肝病毒核酸；另一份按11010/L细胞密度加入1 mL Trizol Reagent，-70冻存，用于提取总RNA. Trizol Reagent (美国invitrogen公司),绿豆芽核酸酶（MBN）（美国Promega公司）,High Pure Viral Nucleic Acid 试剂盒（Roche公司）,Rer-vertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司),Human IFN- ELISA Kit(美国Bender公司),扩增引物均由大连Takara 公司设计和合成.1.2 方法 用High Pure Viral Nucleic Acid 试剂盒提取PBMC中病毒核酸. MBN反应体系：10缓冲液1 L；8.33 nkat MBN 1 L；HBV核酸样品5 L；纯水补足体积至10 L. 37孵育5 min后立即置于冰水浴中，加1 mol/L Tris-Cl(ph8.0)2 L终止反应，总体积12 L. HBVcccDNA引物设计参照参考文献1，两对引物跨越HBV基因组（rcDNA）单链区和3链区. 外侧上游引物：5-CCT CTG CCG ATC CAT CTG CGG AAC-3(nt1255-1279)；外侧下游引物序列为：5-CTG CGA GGC GAG GGA GTT CTT CTT C-3(nt2376-2400). 内侧上游引物：5-CTG AAT CCC GCG GAC GAC CC-3 (nt1441-1460)，内侧下游引物： 5-ACC CAA GGC ACA GCT TGG AGG-3(nt1867-1889). PCR总体积25 L. 首轮反应条件：预变性95180 s,9550 s，724min，共35循环,随后72延伸10 min；次轮反应条件：预变性95180 s,9540 s，6750 s，7260 s，共35循环，随后72延伸300 s. 扩增产物长度分别为1149 bp，426 bp. 设阳性、阴性及空白对照.1.2.1 PBMC中IFN-mRNA的检测 按Trizol试剂说明书提取总RNA. cDNA合成及实时定量RT-PCR：取上述方法提取的总RNA各2 g，用Rer-vertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit分别逆转录20 cDNA. IFN-上游引物：5-GCA GCC AAC CTA AGC AAG-3；下游引物： 5-TCA CCT GAC ACA TTC AAG TTC-3. 内对照-actin 上游引物：5-GAA CGG TGA AGG TGA CAG CAG-3）；下游引物： 5-GTG GAC TTG GGA GAG GAC TGG-3. 按SYBR Premix EX Taq(perfect real time)试剂盒说明书用荧光染料嵌合法（SYBR Green ）同时检测IFN-和-actin表达水平，以IFN-/-actin比值反应IFN-mRNA表达水平高低. 反应在ABI7300实时荧光PCR仪上进行. 每份样本均设3复孔.1.2.2 血清IFN-水平检测 采用双抗体夹心ELISA法检测,依标准品D（）值作标准曲线，再计算待测样品中细胞因子含量，每份样本均设2复孔. 试剂盒灵敏度0.06 ng/L. 统计学分析：计量资料采用xs表示，两组间比较采用t 检验. 统计分析用SPSS13.0软件进行. P0.05为差异有统计学意义.2 结果2.1 PBMC中cccDNA检出率 慢性HBV感染者60例PBMC中cccDNA阳性（图1）检出率48.3%（29/60），其中HBeAg阳性，HBeAg阴性cccDNA阳性检出率分别为60%(18/30)和36%（11/30）. 慢性HBV感染者淋巴细胞末次洗液及30例对照PBMC中均未检测到HBV cccDNA.A： 首轮PCR.3：阳性对照，56：阴性、空白对照；12标本；B： 次轮1： 阳性对照；2，5：阴性、空白对照；4： 标本.图1 PBMC中cccDNA电泳图（略）2.2 血清中IFN-水平 慢性HBV感染者血清IFN-水平低于对照组（t =3.572，P0.05）；PBMC中IFN- mRNA表达水平低于对照组（t=2.734，P0.01，表1）.表1 慢性HBV感染者PBMCs分泌IFN-水平 （略）aP0.05,bP0.05 vs 对照.2.3 PBMC中cccDNA和IFN-表达和分泌的关系 慢性HBV感染者PBMC中cccDNA阳性组IFN-表达和分泌水平低于阴性组（t=2.256，P0.01,表2）.表2 慢性HBV感染者PBMC中cccDNA和IFN-表达和分泌水平（略）bP0.01 vs 阴性.3 讨论 HBV感染慢性化主要与免疫功能紊乱有关. PBMC对机体的免疫反应起重要作用2，3,已成为研究HBV对免疫功能影响的重要途径. cccDNA作为HBV mRNA和前基因组RNA的合成模板，是HBV持续感染并造成不良结局的关键因素. 检测细胞内是否存在cccDNA可作为判断有无HBVDNA复制的指标. 已有研究证实，HBV慢性感染者PBMC可检测出HBVDNA，多数的研究显示，可在PBMC中发现病毒复制的指标，PBMC已成为HBV在肝外的重要复制场所. 我们发现PBMC中有cccDNA存在，阳性检出率为48.3%，其中HBeAg阳性、HBeAg阴性慢性乙型肝炎患者检出率分别为60%（18/30）和36%（11/30）与Torii等4研究结果一致，表明PBMC可能成为肝细胞以外的HBV寄生和复制的重要场所，是形成肝外感染，导致病情隐匿和慢性化的重要原因之一. 慢性HBV感染者存在免疫功能紊乱5，而且PBMC免疫功能紊乱与HBV的复制有明显关系，HBV感染可能影响PBMC产生IFN-的能力6-7，我们也发现慢性HBV感染者PBMC中IFN-表达和分泌水平较对照组下降，与多数研究结果一致. 进一步的cccDNA检测结果显示慢性HBV感染者PBMC中cccDNA阳性组IFN-表达和分泌水平低于阴性组，更直接表明慢性HBV感染者免疫功能紊乱与HBV直接侵犯免疫细胞有关. 本实验证实，HBV可侵犯PBMC并在其中复制，IFN-表达和分泌水平降低，但其分子机制尚不明确.【参考文献】 1 He ML,Wu J,Chen Y,et al. A new and sensitive method for the quantification of HBV cccDNA by real-time PCR J. Biochem Biophys Res Commun,2002,295: 1102-1107.2 Falasca K,Ucciferri C,Dalessandro M,et al. Cytokine patterns correlate with liver damage in patients with chronic hepatitis B and C J. Ann Clin Lab Sci,2006,36(2):144-150.3 Ariyasn T,Tanaka T,Fujioka N,et al. Effects of interferon-alpha subtypes on the TH1/TH2 balance in peripheral blood mononuclear cells from patients with hepatitis virus infection-associated liver disorders J. In Vitro Cell Dev Biol Anim,2005,4(1-2): 50-56.4 Torii N,Hasegawa K,Joh R,et al. Configuration and replication competence of hepatitis B virus DNA in peripheral blood mononuclear cells from chronic hepatitis B patients and patients who have recovered from acute self-limited hepatitisJ. Hepatol Res,2003,25:234-243.5 Priimicaqi LS,Tefanova VT,Tallo TG,et al. Immune-regulation Th1-and Th2-cytokines in chronic infections caused by hepatitis B and C virusJ. Vopr Virusol,2003,48(4): 37-40.6 Fischler B,Nystrom J,Bjomsdottir T,et al. Virus-specific