宫颈鳞状细胞癌组织Smad4表达及临床意义.doc

宫颈鳞状细胞癌组织Smad4表达及临床意义 作者：江忠清, 连成瑛, 林岷, 陈林莺, 张彬, 吴桂珠, 曾赛凡 【摘要】 目的 探讨宫颈鳞状细胞癌（SCC）组织Smad4表达与临床病理特征的关系。 方法 采用免疫组织化学SP法检测28例正常宫颈上皮(NCE)、36例宫颈上皮内瘤变(CIN)和68例SCC组织中Smad4的表达情况,检测Ki-67增殖指数(PI)和CD34微血管密度(MVD)。 结果 Smad4在NCE，CIN及SCC组的阳性表达率分别为75.00%,41.67%和45.59%。从NCE到CIN及SCC,Smad4阳性表达率显著降低(P<0.05)。在SCC组,随Smad4表达降低,盆腔淋巴结转移率显著升高(2=4.446,P=0.035);随Smad4表达增强,PI和MVD均有升高趋势,均未达统计学意义(P>0.05)。SCC组Smad4表达与年龄、FIGO分期、组织学分级、浸润深度、脉管浸润与否及预后无显著相关性(P>0.05)。 结论 Smad4蛋白表达降低可能参与SCC的发生和转移过程。 【关键词】 宫颈肿瘤; 基因,肿瘤抑制; 转化生长因子; 肿瘤转移; 预后; 免疫组织化学 ABSTRACT: Objective To investigate expression of Smad4 and their correlation with clinic-pathologic characteristics in cervical squamous cell carcinoma. Methods The expression of Smad4, proliferation index(PI) of cancer cells labeled by Ki-67 and microvessel density(MVD) labeled by CD34 in 28 cases of normal cervical epithelium(NCE), 36 cases of cervical intraepithelial neoplasm(CIN) and 68 cases of squamous carcinoma of cervix(SCC) were detected by immunohistochemistry SP method. Results The positive rates of expression of Smad4 in NCE, CIN and SCC group were 75.00%, 41.67% and 45.59%, respectively. The positive expression of Smad4 decreased remarkably from a sequence of NCE to CIN and SCC(P<0.05). The rate of pelvic lymph node metastasis in SCC was significantly increased following Smad4 lower expression(2=4.446, P=0.035). The PI and MVD in SCC were increased following Smad4 higher expression, but it was not significant(P>0.05). The expression of Smad4 in SCC was not correlated with patients age, FIGO staging, histological grading, stroma involvement, intravascular infiltration or prognosis(P>0.05). Conclusion The loss expression of Smad4 protein may participate in pathogenesis and metastasis in cervical squamous cell carcinoma. KEY WORDS: cervical neoplasm; genes,tumor suppressor; transforming growth factor beta; neoplasm metastasis; prognosis; immunohistochemistry 转化生长因子(transforming growth factor-,TGF-)控制细胞的生长、分化、凋亡、胚胎发育,激活细胞膜上的型受体(TGF-R),再激活Smad家族蛋白而调节相关基因的表达,在细胞信号转导中起重要作用1。在Smad家族中,DPC4(deleted in pancreatic cancer,locus 4)/Smad4与肿瘤的关系尤为密切1。有报道宫颈癌中Smad4表达缺失2-3。笔者采用免疫组织化学(SP法)检测Smad4在宫颈鳞状细胞癌（SCC）组织的表达情况,探讨其表达与局部肿瘤血管生成、癌细胞增殖、侵袭转移及预后的关系。1 对象与方法1.1 对象临床资料见文献4。1.2 试剂鼠抗人Smad4单克隆抗体(产品编号BA1397,武汉博士德生物工程有限公司),鼠抗人Ki-67单克隆抗体(克隆号MIB1)、鼠抗人CD34单克隆抗体(克隆号QBEnd/10)、超敏免疫组织化学染色试剂盒和DAB染色剂(福州迈新生物技术有限公司)。1.3 方法所有新鲜标本均经4甲醛溶液固定,48 h内取材,石蜡包埋,连续35 m切片。采用免疫组织化学SP法检测CIN和SCC组织中Smad4的表达情况。步骤按说明书操作。Smad4采用EDTA(pH 9.0)水煮高温修复抗原DAB显色,苏木精对比染色。用已知阳性片作为阳性对照,用PBS代替第一抗体作为阴性对照。1.4 结果判断Smad4主要表达于细胞质,部分表达于细胞核。Smad4表达根据文献5的标准判定:弥漫阳性():细胞质中染色深且比较一致,细胞核中有灶状染色;局灶阳性(+):部分区域细胞质和/或细胞核阳性;阴性():细胞质及细胞核均无棕黄色颗粒。在光镜下随机观察10个高倍视野(400),每个视野记数100个肿瘤细胞,计算总阳性标记细胞数。Ki-67标记的增殖指数(PI):CD34标记的微血管密度（MVD）见文献4。1.5 统计学处理采用SPSS 11.5统计软件包分析,半定量资料比较采用2检验或精确概率法检验,定量资料比较采用t检验,变量间的关系采用相关分析,生存情况采用Kaplan-Meier曲线表示,Log rank检验。检验水准=0.05,以P<0.05为差别有统计学意义。2 结 果2.1 Smad4在NCE，CIN及SCC组的表达从NCECINSCC,Smad4表达显著降低(P<0.01,表1)。Smad4在CIN，的阳性表达率分别为41.67%(5/12),54.55%(6/11)及30.77%(4/13),各组之间比较差别无统计学意义(P>0.05)。Smad4在NCE，CIN及SCC组的表达见图1。表1 NCE、CIN及SCC组Smad4的表达（略）2.2 Smad4在NCE，CIN及SCC组的表达与PI的关系在NCE中,Ki-67标记的PI随Smad4表达增强而显著升高(P<0.05)。相关分析显示,Smad4在NCE中表达与PI显著正相关(r=0.469,P=0.012)。Smad4在CIN和SCC中表达与PI均无显著相关性(前者r=0.061,P=0.726;后者r=0.077,P=0.534,表2)。表2 NCE，CIN及SCC组Smad4表达与PI及MVD的关系（略）2.3 Smad4在NCE，CIN及SCC组的表达与MVD的关系Smad4在NCE，CIN及SCC组中表达与CD34标记的MVD均无显著相关性(NCE:r=0.106,P=0.591;CIN:r=-0.281,P=0.102;SCC:r=0.197,P=0.107,表2)。2.4 Smad4 在SCC组的表达与临床病理特征的关系Smad4在SCC组的表达与盆腔淋巴结转移密切相关(2=4.446,P=0.035),而与年龄、FIGO分期、组织学分级、间质浸润深度及脉管浸润无关(P>0.05,表3)。表3 宫颈鳞状细胞癌组Smad4的表达与临床病理特征的关系（略）2.5 Smad4在SCC组的表达与预后的关系将Smad4在SCC组的表达分为阴性和阳性组,两组Kaplan-Meier生存曲线见图2。两组患者的生存率比较差别无显著性,Log rank检验,P=0.379。3 讨 论 有报道,Smad4表达降低或缺失参与宫颈上皮癌变2-3。本研究显示,Smad4在NCE、CIN及SCC中的阳性表达率分别为75.00%,41.67%及45.59%。Smad4在NCE组表达与CIN及SCC组比较,差别有统计学意义(P<0.01),Smad4蛋白在CIN和SCC组表达显著降低,与文献报道一致。1996年,Hahn等发现并克隆出抑癌基因DPC4/Smad46。DPC4/Smad4基因位于人染色体18q21.1,cDNA全长1 656 bp,编码552个氨基酸序列,编码产物为64 kD蛋白质Smad4。TGF-从细胞质到细胞核的信号转导需要Smads蛋白介导。TGF-与其受体结合后,在细胞质内与受体调节型Smad结合,后者与Smad4形成三聚体,进入细胞核与特异的DNA结合,抑制细胞周期关联蛋白CDK4-CyclinD以及下游CDK2-CyclinE复合体活性,阻碍细胞从G1向S期转化,抑制细胞增殖7。Smad4是TGF-信号转导的细胞内信使,其在TGF-诱导基因表达调控和随后的生长抑制中是必不可少的关键转录因子8。TGF-信号传导途径中的任一因子失活均可导致信号传导途径中断,而在该通路中最常改变的是DPC4/Smad49。Smad4突变使其与途径限制性Smads不能形成复合物,不能进入细胞核,从而使TGF-信号转导中断,细胞逃脱TGF-的生长抑制作用而失控,诱发癌症。笔者认为,在CIN和SCC组Smad4表达降低可使TGF-信号转导减弱或中断而不能介导TGF-的生长抑制效应,使细胞生长失控而诱发CIN及癌变。 刘景波等报道,前列腺增生组织Smad4蛋白及mRNA表达显著增高,并与PI显著正相关,Smad4可能促进细胞增殖而参与前列腺增生,Smad4虽为一种肿瘤抑制基因,但可能具有促进增殖作用10。本研究显示,Smad4在NCE中表达与PI显著正相关,随Smad4表达增强,PI显著增加,提示Smad4表达增强也可能促进宫颈上皮细胞增殖瘤变。Smad4基因突变与癌症进展和淋巴结转移密切相关,往往提示预后不良11。吴慧丽等报道,Smad4低表达与结肠癌浸润深度、淋巴结转移及MVD密切相关,提示Smad4低表达可增加肿瘤血管生成12。笔者研究显示,在SCC中,随Smad4表达降低,盆腔淋巴结转移显著升高,随Smad4表达增强,PI和MVD均有升高趋势,但均无统计学意义(P>0.05)。笔者认为,SCC组织Smad4表达降低可能使癌细胞逃脱TGF-的生长抑制作用而促进增殖,同时也可能增加肿瘤血管生成为癌细胞提供营养而加速转移。本研究结果还显示,Smad4在SCC组表达与年龄、FIGO分期、组织学分级、间质浸润深度及脉管浸润均无显著相关性(P>0.05)。 胃癌Smad4阳性表达者肿瘤细胞分化好,生长速度慢,侵袭和转移能力弱,预后较好13。在本研究中,将Smad4在SCC组表达分为阴性和阳性组,描绘两组患者Kaplan-Meier生存曲线,阴性组生存率与阳性组比较无统计学意义。Smad4表达与SCC预后关系的研究刚刚开始,可能有不同结果,有待深入研究。【参考文献】 1Moustakas A,Souchelnytskyi S,Heldin C H. Smad regulation in TGF- signal transductionJ. J Cell Science, 2001,114(Pt24):4359-4369.2Baldus S E,Schwarz E,Lohrey C,et al. Smad4 deficiency in cervical carcinoma cellsJ. Oncogene, 2005,24(5):810-819.3Maliekal T T,Antony M L,Nair A,et al. Loss of expression,and mutation of Smad 2 and Smad 4 in human cervical cancerJ. Oncogene, 2003,22(31):4889-4897.4林 岷，江忠清，连成瑛，等. 宫颈鳞状细胞癌局部淋巴管生成与浸润转移及预后的关系J. 福建医科大学学报， 2008,42（2）：116-120.5Wilentz R E,Su G H,Dai J L,et al. Immunohistochemical labeling for dpc4 mirrors genetic status in pancreatic adenocarcinomas:a new marker of DPC4 inactivation J. Am J Pathol, 2000,156(1):37-43.6Hahn S A,Schutte M,Hoque A T,et al. DPC4,a candidate tumor suppressor gene at human chromosome 18q21.1J. Science, 1996,271(5247):350-353.7Kjellman C,Olofsson S P,Hansson O,et al. Expression of TGF-beta isoforms,TGF-beta receptors,and Smad molecules at different stages of human gliomaJ. Int J Cancer, 2000,89(3):251-258