差异基因表达分析法在胃癌中的应用.doc

差异基因表达分析法在胃癌中的应用【摘要】 目的探讨用蛋白质芯片技术筛选胃腺癌患者血清蛋白质表达谱,寻找血清中的标志性蛋白。方法采用蛋白质生物芯片表面增强激光解析电离飞行时间质谱（SELDI）技术,运用SAX2 (Strong Anionic Exchanger)蛋白质芯片检测胃腺癌患者、胃炎患者和健康者血清,建立诊断模型,然后进行单盲模型验证。结果发现5910Da、5084Da和8691Da的三个蛋白质荷比峰(M/Z)在胃腺癌和健康组比较中具有显著性差异。5910Da、6440Da的两个蛋白质荷比峰(M/Z)在胃腺癌和胃炎组中比较具有显著性差异。结论建立了胃腺癌的血清蛋白指纹质谱，为以后的胃癌蛋白质组学研究奠定了一定的基础，建立了以5910Da、5084Da、8691Da和6440Da四个蛋白质峰为模型区分胃腺癌与非胃腺癌的血清蛋白表达质谱诊断模型，为胃腺癌的临床诊断提供了一条崭新的途径和方法。 【关键词】 表面增强激光解析电离-飞行时间质谱蛋白质芯片生物标记胃腺癌Application of Serum Proteomic Patterns for Detection of Gastric Adenocarcinoma serum protein profiling ofastricadenocarcinoma by surface-enhancedlaser desorption/ionization time of flight mass spectrometry(SELDI-TOF-MS) to discovering the discriminalory proteins.MethodsThe diagnosis model was established by SELDI technique with SAX2 chip to detect the serum of patients with gastric adenocarcinoma, gastricism and healthy persons, and tested by single-blind model.ResultsThree specific protein fingerprint biomarkers massed at 5910, 5084, 8691 between gastric adenocarcinoma group and control group with statistical significance. Two specific protein fingerprint biomarkers massed at 5910, 6440 between gastric adenocarcinoma group and gastricism group with statistical significance.Conclusions A gastric adenocarcinoma protein fingerprint and a foundation for later study of gastric cancer proteomics is developed. The diagnostic model of the protein profiling(5910Da, 5084Da, 8691Da, 6440Da) for distinguishing gastric adenocarcinoma from non-gastric adenocarcinoma is established to aid a new approach in clinical diagnosis for gastric adenocarcinoma. 2.Institute of Cell Biology, Zhejiang University, Hangzhou 310031,China)Abstract: Purpose Toscreen out 胃腺癌是常见的癌肿之一，占全部恶性肿瘤的第三位，占消化道恶性肿瘤之首,而且近年来发病有明显年轻化趋势。相当多的胃腺癌患者发现时已经是晚期，我国每年死于胃腺癌约16万人。目前已有的肿瘤标志物单项指标检测胃腺癌的灵敏度仅为18%40%，联合应用的结果虽然可达60%80%，但假阳性率较高，难以用于早期诊断。因此，寻求早期诊断胃腺癌的特异方法是目前临床亟待解决的难题。我们利用表面加强激光解吸离子化飞行时间质谱（surface?鄄enhanced laser desorption and ionisation，SELDI）技术，对胃腺癌患者与正常人和胃炎患者血清中的蛋白质进行对比分析，筛选可用于临床胃腺癌早期诊断的特异性生物标记物。 1 材料与方法 1.1 血清样品 所有病人血清样品均为2003年8月2004年6月台州市立医院手术后病理检查确诊为胃腺癌患者的术前抽检标本，对照样品来自经健康查体正常的健康志愿者及经病理检查为活动性胃炎患者的血清。全血采集在10ml血清分离管中，4 000r/min离心10min。取30l血清分装在0.5ml离心管中，于-80冰箱保存。33例胃腺癌,其中男性22例，女性11例，平均年龄56.5岁(4571岁)；31例健康志愿者其中男性20例，女性11例，平均年龄63岁(4370岁)，30例胃炎患者其中男性20例，女性10例，平均年龄58.9岁(4670岁)。另盲法试验组36例（15例胃腺癌、10例健康志愿者、11例胃炎患者）。 1.2 仪器和试剂 美国赛弗吉公司(Ciphergen Biosystems, Inc.)生产的表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱仪(Surface Enhanced Laser Desorption Ionization?鄄time OF Flight?鄄Mass Spectrometry, SELDI?鄄TOF?鄄MS)及该公司配套的蛋白质芯片SAX2 (Strong Anionic Exchanger,强阴离子交换) 芯片。 主要试剂：尿素、乙腈、三氟乙酸等均购自Sigma公司，SPA(Sinapinic Acid)购自CiphergenBiosystems公司。U9缓冲液(9M Urea, 2% CHAPS,1%DTT)，U1缓冲液(用50mM Tris?鄄HCl缓冲液，9倍稀释U9缓冲液)，SAX2缓冲液(100mM Tris?鄄HCl pH9.0)。 1.3 方 法 血清样品准备：融解冰冻血清并于4离心20 000转，10min。每个样品取20l血清，分别置于1.5ml离心管中。加30lU9缓冲液于每一试管，于4振摇20min，每管加入100lU1缓冲液，盖严并于4震荡30min。 芯片平衡：在芯片每个芯池中加入150l相应的结合/洗脱缓冲液，置于振荡器上，室温孵育5min后除去缓冲液，重复上述操作1次。 芯片与蛋白质结合反应：从上述蛋白变性后的血清样品中取50l样品，加入200l相应的结合/洗脱缓冲液，使最后上样的样品总共稀释约40倍，置于振荡器上，室温孵育60min后除去样品。 芯片冲洗：每孔中加入150l相应的结合/洗脱缓冲液，置于振荡器上室温孵育5min，除去缓冲液，重复上述操作2次，最后芯片用相应pH的1mM HEPES淋洗。去除水后，晾干芯片。 加能量吸收分子（energy absorbing Molecule，EAM）：取出芯片，在Sinapinic Acid中加入200l乙氰，200l 1TFA，充分振荡5min使溶解，离心1min；每孔分2次加Sinapinic Acid（0.5l/次），两次之间允许各孔风干。 读片程序的编辑：用加有5个多肽标准品的芯片校正质谱仪的分子量。 数据的读取：在Ciphergen ProteinChip软件中以设定的读片程序读取芯片。结合EAM后的蛋白质在激光的脉冲下从芯片表面解离，在电场作用下，不同大小的蛋白质以不同的飞行速度在真空管中飞行的时间不同，从而得出精确的分子量（M/Z）和电子流量。本实验应用激光强度185，灵敏度7。 数据处理及统计学分析：用Ciphergen ProteinChip软件和Biomarker Wizard软件对芯片检测得到的蛋白质相对含量及蛋白质质荷比数据按数据要求进行处理。Biomarker Wizard软件用方差分析计算不同组相同质荷比的蛋白质含量的P值。用数据挖掘软件Biomarker Pattern(其采用的是决策树方法对目标对象进行分类)对数据分组及相关性进行分析。 盲法分析方法：用建立的蛋白质谱模型对36例未知的血清标本（包括胃腺癌患者、胃炎患者与健康人）进行盲法预测，验证模型。 2 结 果 2.1 胃腺癌组与正常人组比较 分别对64例样本检测质谱图进行分析比较，共得到蛋白质峰为45个，其中5910Da、5084Da、8691Da这三个蛋白质峰差异有统计学意义。其中在5910Da峰处胃腺癌的患者，均比正常人高，5084Da峰处在胃腺癌患者中均在该峰旁边出现二联峰或三联峰，峰的高低与肿瘤的分化恶性程度正相关；在这3个峰中只有8691Da峰的值为肿瘤患者低于正常人（见图1、表1）。33例胃腺癌的样品中，有30例被准确检出为胃腺癌 ，31例健康志愿者中有29例确定为非胃腺癌。结果表明，该方法的灵敏度为90.91%(30/33)，特异性为93.55%(29/31)，阳性预测值为93.75(30/32)。这三个蛋白质峰数据建立蛋白质谱模型，用25例样本进行盲法测试，15例胃腺癌中14例被准确检出，10例健康志愿者全部被准确检出。其敏感性为93.3%（14/15），特异性为100%（10/10）。 2.2 胃腺癌组与胃炎组比较 分别对63例样本检测质谱图进行分析比较，共得到蛋白质峰为38个，其中5910Da、6440Da这两个蛋白质峰差异有统计学意义。其中在5910Da峰处胃腺癌的患者，均比胃炎高，6440Da峰处胃腺癌的患者均比正胃炎低（图2），5084Da峰处在胃腺癌和胃炎患者中均在该峰旁边出现二联峰或三联峰，可见该峰可能与胃损伤有关。利用这两个蛋白质峰数据建立蛋白质谱模型，用26例样本进行盲法测试，15例胃腺癌中14例被准确检出，11例胃炎患者中有10例被准确检出。其敏感性为93.3%（14/15），特异性为90.9%（10/11）。 3 讨 论 蛋白质组学研究是与癌发生学相对应的一个领域，任何肿瘤的发生在出现病理变化之前，细胞内的蛋白质在成分和数量上都会有相应的改变，所以在理论上，通过对蛋白质的动态观察可以筛选出疾病早期的指标。目前，蛋白质组学研究的主要技术是双向电泳和质谱等。虽然双向电泳的技术很成熟，但它复杂的实验过程和大量的标本需求不适应大规模的标本检测，限制了双向电泳直接用于临床检测。而对SELDI技术而言，其表面可结合特定的蛋白质，可以直接检测相对原始的生物样品，并可同时进行多样品、多蛋白的检测，从而提供了适合于蛋白质的研究16。目前用SELDI蛋白芯片技术获得有意义成果的数量已经日益凸现，尤其在一些肿瘤诊断上，如前列腺癌7、卵巢癌8、乳腺癌9等的诊断。 胃癌具有起病隐匿，早期常因无明显症状而漏诊，易转移与复发，预后差等特点。目前，已有的肿瘤标志物单项指标的灵敏度仅为18%40%，联合应用的结果虽然可达60%80%，但假阳性率较高，难以作为早期诊断的指标。所以，利用SELDI技术检测胃腺癌，可以准确地将其分辨出来，并在质谱图中可以清楚显示差别，说明该方法对胃腺癌的诊断具有重要的意义，并可作为临床观察疗效的指标之一。 本实验选用33例手术后病理检查确诊为胃腺癌患者的术前抽检标本和31例健康志愿者及30例活动性胃炎患者的血清标本，采用美国CiphergenBiosystems公司生产的表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱仪（SELDI?鄄TOF?鄄MS）选用 SAX2（强阴离子交换芯片）。在胃腺癌与胃炎患者中发现质/荷比为5910Da、6440Da处两个峰的同时变化，具有明确的诊断意义。其中在5910Da的蛋白质较正常人表达明显升高，而6440Da处则低表达。特别是在5084Da峰旁边出现的二联峰或三联峰，出现在胃腺癌和胃炎病人中，说明5084Da峰的存在可能是显示患者存在胃损伤的表现。而在胃腺癌与健康者组中发现5910Da、5084 Da、8691 Da这三个蛋白质峰差异有统计学意义。其中在5910Da峰处胃腺癌的患者均比正常人高，5084Da峰处胃腺癌患者中均在该峰旁边出现二联峰或三联峰，其峰的高低与肿瘤的分化恶性程度正相关，从而提示该蛋白质可能存在的羟基化转录后修饰在胃腺癌发生发展中的地位。在这三个峰中只有8691Da峰的值为肿瘤患者低于正常人。通过5910Da、5084 Da、8691 Da和6440 Da四个蛋白质峰建立区分胃腺癌与非胃腺癌的血清蛋白表达质谱诊断模型，为胃腺癌的临床诊断提供了一条崭新的途径和方法。通过这几个峰的鉴别，其结果明显高于常规肿瘤标志物的联合检测。 综上所述，运用该种技术，能够采用较少量血清对高危人群进行筛查，及早发现胃腺癌患者，并且可通过进一步研究以明确其临床意义。该实验的发现可为临床胃腺癌的血清学诊断及进一步的胃腺癌早期诊断提供良好前景。【参考文献】 1何大澄，肖雪媛.SELDI蛋白质芯片技术在蛋白质组学中的应用J. 现代仪器, 2002(1):1.2Shevchenko A, Wilm M, Mann M.J Protein Chem,1977,16(5):481.3Weinberger SR,Boschetti E,Santambien P, et al. 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