幽门螺杆菌NCTC11639基因hpaA的克隆表达及鉴定.doc

幽门螺杆菌NCTC11639基因hpaA的克隆表达及鉴定 作者：谷祯梅 籍会彩 向春艳 温淑娟【摘要】 目的 获取幽门螺杆菌（Hp）hpaA基因的序列，预测其编码蛋白hpaA作为候选疫苗的可行性，在大肠杆菌表达系统中表达hpaA。方法 提取Hp标准株NCTC11639的基因组DNA，使用PCR扩增hpaA基因，克隆入pGEMT载体中测序，并进行同源性分析。将hpaA克隆入表达载体pGEX4T1中，诱导表达，SDSPAGE电泳鉴定。结果 同源性分析表明hpaA具有很高的保守性，成功构建出可以高效、分泌型表达hpaA的原核表达系统。结论 hpaA具有高保守性，在Hp各菌株中普遍存在，是有良好应用前景的Hp候选疫苗。 【关键词】 hpaA基因； 克隆表达； SDSPAGE 【Abstract】 Objective The intention of this study can be subscribed in three aspects: obtaining the sequence of Helicobacter pylori gene hpaA,predicting whether protein hpaA has potential to become a vaccine candidate of Hp and expressing hpaA in E.coli heterogeneous expression system. Methods The hpaA gene was amplified from the genome of Hp strain NCTC11639 and then cloned into vector pGEMT. The sequence has been obtained by sequencing the recombinant vector. The pGEX4T1 was used to construct expression system in E.Coli strain BL21 and the expression result verified by SDSPAGE. Results The homogeneous analysis showed that hpaA is a highly conservative gene.An efficient and secretive expression system in BL21 was constructed. Conclusion The research indicates that hpaA is a universal and highly conservative gene and hpaA is a promising vaccine candidate of Helicobacter pylori. 【Key words】 Gene hpaA；Clone and expression；SDSPAGE 幽门螺杆菌(helicobacter pylori，Hp)是慢性胃炎和消化性溃疡的重要致病菌，并与胃腺癌和胃粘膜相关B细胞淋巴瘤的发生密切相关。如何有效控制Hp感染，一直为国内外学者所关注。目前临床上多采用抗生素治疗Hp感染，但Hp容易产生耐药性，导致抗生素治疗失效，并且Hp未能根除，大多数患者很快又旧病复发，因此开发疫苗被认为是控制Hp感染最有效的方法。但迄今为止，尚未开发出成功Hp的疫苗，筛选合适的抗原表位仍是目前Hp疫苗研究的热点。Hp的主要粘附素为N乙酰神经氨酰乳糖结合原纤维样血凝素(Nacetylneuraminyllactosebinding haemagglutinin，NLBH)，hpaA是其亚单位，并且作为核心组成部分，主要参与编码鞭毛鞘壳和外膜中的脂蛋白1-3。hpaA在Hp感染过程中不可或缺，hpaA突变的Hp菌株无法在小鼠体内定植4，目前hpaA的具体功能尚未阐明。本项研究旨在探讨hpaA蛋白作为抗Hp感染的候选疫苗的可行性，拟构建可高效表达hpaA的原核表达系统，并获得重组hpaA蛋白。 1 材料和方法 1.1 菌株与培养基 Hp标准株NCTC11639、大肠杆菌Top10及BL21来源于本实验室菌种库。重组大肠杆菌所用培养基为LB培养基。 1.2 实验试剂 细菌基因组提取试剂盒、质粒小量提取试剂盒、DNA Marker均购自天为时代，一管式PCR反应体系及PCR产物纯化试剂盒购自英韦创津公司，限制性内切酶BamH I和Hind III以及低分子量蛋白质Marker购自TaKaRa公司。 1.3 扩增及克隆 设计用于扩增hpaA的引物，并送交TaKaRa公司合成。 hpaA1：5GGA TCC ATG AAA GCA AAT AAT CAT TTT AAA G3 hpaA2：5AAG CTT TTA TGG GTT TCT TTT GCC TTT TAA3 利用以上引物和一管式PCR反应体系，从提取到的Hp NCTC11639基因组中扩增hpaA。 扩增条件：盖温105，预热94 10 min，(94 30 s，50 1 min，70 2.5min)35，最后70再延伸6 min。 扩增产物用PCR产物纯化试剂盒纯化后，连入T载体pGEMT，转入大肠杆菌Top10感受态细胞中，37在含有Xgal的平板上培养14 h，利用Amp抗性和蓝白斑筛选出白色重组菌落，微量PCR鉴定，挑取阳性菌落，提取重组质粒，双酶切鉴定，保存阳性克隆菌种，提取的质粒送交TaKaRa进行测序。从重组pGEMT中用Bam H I和Hind III，双酶切下hpaA，克隆入表达载体pGEX4T1中，转化入大肠杆菌BL21感受态细胞中，Amp抗性平板培养基上筛选阳性克隆，进行PCR及双酶切鉴定。重组大肠杆菌30下4 h，150 rpm，0.05 mM IPTG诱导表达，将产物进行SDSPAGE鉴定。 2 结果与分析 2.1 PCR扩增hpaA 扩增出的hpaA片段长度符合预测，将PCR产物分别连入pGEMT中获得重组T载体，经测序证明为hpaA基因（图1）。 2.2 同源性比较 对测序结果分别与GeneBank上已公布的8株Hp的hpaA序列进行同源性比较，结果表明NCTC11639的hpaA基因同源性达到94.34%96.72。 2.3 hpaA的诱导表达 从重组pGEMT克隆中切下hpaA，克隆入pGEX4T1中，转化大肠杆菌BL21，对阳性克隆进行双酶切（图2）和PCR鉴定，诱导表达，上清液经SDSPAGE鉴定(图3)。结果表明GSThpaA为可溶性表达，重组蛋白主要存在于上清液中。 3 讨论 Hp与胃炎、消化性溃疡、胃腺癌及胃粘膜相关B细胞淋巴瘤等消化道疾病密切相关。目前Hp疫苗研究热点主要集中在尿素酶（Ure），毒力因子CagA和VacA，热休克蛋白60（Hsp60）等亚单位保护性抗原上4。但Ure难以诱导出全面而稳定的保护性免疫应答5；CagA和VacA变异较大，且CagA是否为Hp感染所必需还存在一定争议6；Hsp60和人体自身蛋白有较高同源性，用Hsp60免疫小鼠只能获得局部保护性免疫应答，并且会导致小鼠肠胃炎7，其作为疫苗的安全性和有效性尚需进一步验证。因此，仍需进行研究以筛选出更合适的Hp候选疫苗。 NLBH是Hp的主要粘附素之一，它能与多种胃上皮细胞表面成分如神经节苷脂(GM3)、硫酸脑苷脂(SLC)及层粘连蛋白上的唾液酸乳糖等结合，使Hp紧密粘附于胃上皮细胞，从而进一步发挥对胃粘膜的损伤作用。所有Hp菌株均有hpaA基因，并且其核苷酸序列高度保守。Hp感染患者血清中出现的hpaA抗体能与hpaA融合蛋白发生免疫反应，因此hpaA作为Hp疫苗的候选抗原非常可行。 本研究克隆并表达了幽门螺杆菌NCTC11639的hpaA基因，与Genbank上已经公布的Hp菌株hpaA序列进行对比，同源性达到94.3496.72，表明hpaA具有较高的保守性。目前已成功构建了可高效表达hpaA的原核表达系统，拟分离纯化重组蛋白，利用临床阳性血清进行鉴定。【参考文献】 1 Kim N, Weeks DL, Shin JM, et alProteins released by Helicobacter pylori in vitro. J Bacteriol, 2002, 184(22):61556162.2 Evans DG, Karjalainen TK, Evans DJ Jr, et alCloning，nucleotide sequence，and expression of a gene encoding an adhesin subunit protein of Helicobacter pyloriJ Bacteriol, 1993,175(3): 674683.3 Baik SC, Kim KM, Song SM, et al. Proteomic analysis of the sarcosineinsoluble outer membrane fraction of helicobacter pylori strain 26695. J Bacteriol, 2004, 186(4): 949955. 4 Carlsohn E,Nystrom J,Bolin I, et al. HpaA is essential for helicobacter pylori colonization in mice. Infect Immun, 2006, 74(2):920926. 5 李丙生，周曾芬幽门螺旋杆菌疫苗的研究现状胃肠病学和肝病学杂志，2004，13（2）：2032066 陈洪