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真核表达质粒pVAX1的应用 作者：曲云鹏，刘建国，杨德琴【关键词】 pVAX1；DNA疫苗；质粒从20世纪90年代DNA疫苗诞生以来，其在医学领域已取得长足的进步和发展，它的出现为预防感染性疾病的发生提供了一种新思维、新方法。但是，目前在DNA疫苗中所应用的载体质粒仅局限于实验室研究和动物实验，如何使DNA疫苗应用于人体实验，最终走向临床研究，是摆在当今广大科研人员面前的关键难题。pVAX1的出现为解决这一难题提供了可能，它是由美国食品和药品管理委员会（FDA）推荐的唯一可以应用于人体实验的载体质粒。迄今为止，关于pVAX1的研究已涉及动物和临床试验，笔者将对其研究现状和应用进展作一综述。 1 pVAX1的基本特性 pVAX1是在载体pcDNA3.1的基础上改建而成的一种新型真核表达载体，大小为3.0 kb。该质粒用卡那霉素抗性筛选基因替代pcDNA3.1中的氨卞霉素抗性筛选基因，最大程度地减少抗性筛选基因和人类基因组发生重组的可能性。pVAX1含有多个克隆酶切位点允许同时克隆多个大片段的目的基因，强启动子pCMV和BGH poly A信号可以在哺乳动物细胞中高水平表达重组蛋白1。pVAX1又是一种非融合载体，要求插入序列中时必须包含一段KozaK的翻译起始序列和一个起始密码子（ATG）以引导正确的翻译，典型的KozaK共有序列为“ANNATGG”，其-3位的A和+4位的G对正确插入甚为关键，在插入序列中还需包括一个终止密码子以正确终止基因表达2。 2 pVAX1在人类疾病防治研究中的应用 2.1 肿瘤防治研究 肿瘤在人群中的发病率呈逐年上升的趋势，传统的外科手术加放化疗的治疗方法存在组织损伤大、副作用明显、恢复时间长和造成其他组织器官损害等缺点，达不到理想的治疗效果。利用pVAX1为载体，构建可应用于人体实验的肿瘤DNA疫苗是肿瘤预防和治疗的未来发展方向之一。 新生毛细血管的形成为肿瘤提供必要的营养，是瘤体组织生长和转移的先决条件。内皮他定是一种内源性血管生成抑制剂，通过抑制血管内皮细胞的繁殖，抑制毛细血管的形成，达到抑制肿瘤生长的作用。动物实验表明内皮他定能抑制多种肿瘤细胞的生长，并且不具有耐药性和细胞毒性。有学者从重组质粒pGEM-T-EN中扩增出编码内皮他定的基因片段，经EcoR I和Kpn I双酶切后定向插入真核表达载体pVAX1，构建pVAX-sEN，通过瘤体内直接注射攻击肝癌动物模型，3 d后发现癌组织明显变小，用ELISA法在瘤体内检测到pVAX-sEN蛋白表达产物，免疫组化发现肿瘤组织内毛细血管密度明显降低3，但治疗效果不尽满意，需作进一步探索。 DNA疫苗治疗恶性肿瘤是一种理想的治疗方式，各种肿瘤细胞表面抗原的多样性要求抗体的广谱性。Konopitzky等4在蛋白和mRNA水平比较了正常组织和肿瘤组织，发现钙离子激活氯化物通路2（CLCA2）是大多数肿瘤细胞所共有的抗原。通过RT-PCR可扩增出编码CLCA2主要功能蛋白的基因片段，利用分子克隆技术分别将三段基因克隆到pVAX1，构建多个重组质粒，通过脂质体转染293璄BNA细胞，诱导其在真核细胞中成功表达，为研制新型抗癌疫苗打下了基础。并不是所有的共同多价抗原都适合用于基因疫苗。Smith等5 利用PCR技术扩增出编码黑色素瘤多价抗原表位的基因片段，利用分子重组技术与pVAX1结合构建真核表达质粒。通过转染COS7细胞进行体外攻击实验观察到，初次免疫时细胞毒性T淋巴细胞可以产生多种抗体，而再次免疫只能产生一种抗体，提示有免疫耐受现象出现。对于一些组织来源和发生比较特殊的肿瘤，DNA疫苗也达不到理想的效果。Margot6将与肿瘤密切相关的细胞表面黏附分子CD44外显子V2的编码基因，克隆到pVAX1中构建的pVAX1璙2注入淋巴瘤动物模型体内，未在动物体血清中检测到特异性抗体，没有预期的治疗效果，且在胸腺内发现癌转移灶，可能是由于淋巴瘤本身来源于免疫系统，有着特殊的免疫逃逸机制，并且能诱导机体产生免疫耐受，一般抗原呈递细胞不能将其识别。另外，肿瘤DNA疫苗常常由于给药途径不理想，造成其表达不充分，达不到满意的效果。有学者利用黑色素瘤细胞表面主要抗原蛋白酪氨酸相关蛋白2(TRP-2)的编码基因，构建真核表达质粒pVAX1-C(SVYD)C和pVAX1-C(TAYR)C，通过电穿孔的方法攻击动物模型，2个月后发现实验组动物肺内转移灶明显少于对照组，或者没有，从脾脏和外周血中获得大量CD8T淋巴细胞7。该研究成果为探索肿瘤DNA疫苗用药途径提供了新的方法。 2.2 口腔疾病防治研究 牙周炎是世界范围内的疾病，是成年人丧失牙齿的主要原因。牙龈卟啉单胞菌（Pg）是牙周炎的主要病原菌，编码基因rgpA表达的多肽是Pg主要的酶促反应区和血细胞凝聚反应区，是牙龈卟啉单胞菌（Pg）的主要毒力因子。Yonezawa等8从Pg33277基因组中PCR扩增目的基因rgpA，双酶切后定向克隆插入pVAX1，构建pVAX-rgpA经微球包裹后，通过基因枪直接注射动物腹部，5 d后观察到病损部位明显减小，并从血清中检测出特异性抗体，电泳检测获得预计大小的蛋白条带，证实pVAX1-rgpA可以有效抑制牙龈卟啉单胞菌（Pg）在动物体内生长。 龋病是口腔中的常见病和多发病，危害人类健康，变形链球菌是其公认的主要致病菌。贾荣等9将变形链球菌表面蛋白PAc编码A区和P区（A-P）的序列及葡糖基转移酶的GLU序列克隆到真核载体pVAX1中，构建融合防龋DNA疫苗pGLUA-P。pGLUA-P转化的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导能够表达完整的融合蛋白；转染大鼠原代肌母细胞，采用免疫组化的方法可以检测到特异性蛋白的表达。于飞等10在上述体外研究的基础上，将pGLUA-P经股四头肌注射免疫定菌鼠，ELISA法检测的结果显示实验组动物体内的血清IgG和唾液IgA水平明显高于对照组，实验组Keyes龋齿记分显著低于对照组11。 2.3 循环系统疾病防治 急性局部末端动脉缺血，是一种进行性加重疾病，是造成肢体残缺的主要原因。肝细胞生长因子（HGF）已被证明可以有效促进血管内皮细胞生长。Morishta等12在pVAX1巨细胞病毒启动子下游插入大小为2.2 kb的目的基因片断，构建pVAX1-HGF，直接行周围动脉炎患者肌肉注射，3个月后发现患者并未出现过敏、局部水肿和视网膜病变等并发症，超声血管造影后经体层数字剪影可发现有新生末梢动脉形成，血管内皮溃疡面积逐步缩小，肢体末端缺血情况得到明显改善，证实pVAX-HGF可以有效改善末端血液循环，保存患肢。该方法与血管再通术等其他治疗手段相比较有更少的并发症出现。 急性心肌梗死（MI）是猝死的常见原因，严重威胁人类健康。肝细胞生长因子（HGF）能有效促进血管增生，改善局部血液循环，以往的给药途径大多是通过心脏直接注射或通过特殊载体的介导输送人体内，效果不佳。Kondo等13经胸腔静脉通过超声微球破溃的方法使重组质粒pVAX1-HGF直接到达心脏病变部位，治疗MI动物模型，7 d后在心血管中检测到pVAX1-HGF蛋白表达产物，3周后观察到左心室的尺寸明显变小，左心室重量明显低于对照组，免疫组化检测发现病变部位的毛细血管大量增生，局部血液循环改善明显。 2.4 神经系统疾病防治 随着老年人在人口结构中的比重不断上升，老龄化社会已经来临。阿尔茨海默病（AD）是一种被国内外学者所公认的造成早老性痴呆的疾病。该病是由于淀粉状蛋白A沉积于神经纤维表面，破坏脑组织中记忆单元，造成的病理性神经损害。对于该病的治疗，科研工作者做了大量的探索。有学者用A多肽直接免疫转基因动物，造成脑组织膨出等严重并发症，没有取得令人满意的效果。He等14利用DNA疫苗可有效穿过血脑屏障的特点，根据编码A蛋白的基因序列，设计引物，分段扩增目的基因，酶切后定向插入pVAX1中，构建pV-GE1、pV-GE2、pV-GE3和pV-GE4，分次分组肌注免疫BALB/C小鼠，最后一次免疫3周后，可从动物血清中检测到A的特异性血清IgG抗体，并且没有严重的并发症出现，该研究成果为pV-GE系列质粒防治AD打下了基础。 2.5 生殖医学研究 卵透明带是包被于卵母细胞外及着床前胚胎外的非细胞结构，其中组分pZP3作为精卵结合的第一受体，在诱发精子顶体反应及受精中起着重要作用。从pZP3-cDNA-pBluescript中，扩增出目的基因片段，酶切后定向插入pVAX1构建pVAX1-pZP3，脂质体转入Hela细胞，诱导其蛋白表达，RT-PCR检测到mRNA，Western印迹法在硝酸纤维素膜上观察到与预计大小相同的蛋白条带15。Sun等1用微球包裹pVAX1-pZP3，通过口服途径免疫动物，5 d后在腹腔绒毛内检测到pVAX1-pZP3及蛋白表达产物，并在生殖道黏膜内检测到特异性IgA抗体，证明成功诱发黏膜免疫，且未引起卵巢功能紊乱。 2.6 传染性疾病防治研究 乙型肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）所引起的一种世界范围内的严重的传染性疾病，黏膜免疫是有效免疫途径之一，但裸露DNA经消化道黏膜时在胃酸及各种蛋白酶的作用下极易分解，达不到理想的免疫效果。采用RT-PCR技术从HBV阳性患者的血清中扩增出目的基因片断，经EcoR I/BamH I双酶切后，定向插入pVAX1中，再用生物降解材料（PLGA）包裹后，转染大鼠单核巨噬细胞株264.7，培养后检测出细胞蛋白表达产物特异性抗HBsAg抗体产生。动物实验证明PLGA璂NA经消化道途径可有效刺激黏膜产生INF-r和HBV特异性抗体，通过该途径产生的细胞免疫和体液免疫效价明显高于经肌肉注射途径诱导的免疫16。 严重急性呼吸道症候群（SARS）是由冠状病毒引起的呼吸系统急性传染病。He等17扩增出编码冠状病毒核心蛋白的基因S，经EcoR V和Xho I双酶切后，构建重组表达质粒pVAX璖，通过脂质体介导转染Hela细胞，检测到特异性蛋白条带，为进一步的动物和临床实验打下了基础。 3 pVAX1在禽类疾病防治研究中的应用 家禽与人类的关系较为密切，流行于家禽中的疾病不仅能够带来巨大的经济损失，而且也会威胁到人类的健康。传染性黏液囊病（IBD）是造成鸡雏死亡的主要原因，已经证实该病是由传染性黏液囊病毒（IBDV）感染引起的，将1 367 bp大小的编码IBDV功能蛋白的基因VP2分三段扩增，克隆到中间载体pUC18后酶切构建pVAX1-ibdvp2，该重组质粒转染鸡胚胎成纤维母细胞，诱导真核表达，检测到特异蛋白，动物实验证实直接肌注该重组质粒可使鸡雏有效避免传染性黏液囊病毒（IBDV）18。 pVAX1不仅在预防和治疗疾病中有着不可替代的地位，而且在筛选病毒毒力因子中也发挥着重要的作用。鸡新城疫由新城病毒（NDV）引起，该病毒为大小15 186 bp的单链RNA，其基因序列中P基因为主要蛋白编码基因，为增加DNA疫苗免疫的特异性，需要筛选病毒主要的毒力因子。Huang等19通过RT-PCR合成P基因不同功能片断，分别构建pVAX1璿和pVAX1瓀，转染DF1细胞检测到特异蛋白，免疫鸡胚胎发现pVAX1璿免疫原性远高于pVAX1瓀，从而证明P基因编码的V蛋白是新城病毒的主要毒力因子，该研究结果为研发新一代新城病毒疫苗提供了试验依据。 4 展望 近年来有关DNA免疫的研究甚热，已成功构建了一大批具有临床意义的重组质粒。随着DNA疫苗技术的不断进步和发展，pVAX1的应用日益受到关注。相信在不远的将来，以真核重组质粒为基础的DNA免疫治疗技术将形成临床预防和治疗的主流，会使整个医疗事业的面貌发生巨大变化。【参考文献】 1 Sun CJ, Pan SP, Xie QX, et al. 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