糖尿病早期大鼠背根神经节IGFI与GAP43mRNA的表达.doc

糖尿病早期大鼠背根神经节IGF-I与GAP-43 mRNA的表达【摘要】 目的：观察糖尿病早期（2周）大鼠背根神经节中胰岛素样生长因子-I （IGF-I）与生长相关蛋白43（GAP-43）基因的表达变化以及胰岛素对其的影响。方法：按60mg/kg予SD大鼠一次性腹腔注射链脲佐菌素制备胰岛素依赖性糖尿病大鼠模型，然后将造模成功的大鼠随机分成模型组与治疗组，治疗组于造模成功后第2天开始皮下注射胰岛素进行治疗，qd。2周后取各组大鼠背根神经节（DRG），Trizol法提取总RNA，应用RT-PCR法测定IGF-I与GAP-43 mRNA的表达。结果：在糖尿病早期大鼠DRG中，IGF-I，GAP-43 mRNA的表达显著下调,胰岛素能明显上调IGF-I mRNA的表达，对GAP-43 mRNA的表达有上调趋势。结论：在早期糖尿病DRG中IGF-I，GAP-43 mRNA表达下调，参与了糖尿病外周神经病变的发生发展。 【关键词】 糖尿病 胰岛素样生长因子-I 生长相关蛋白-43 背根神经节 大鼠 Abstract Objective: To observe the changes of expression of IGF-I and GAP-43 mRNA in rat dorsal root ganglion of early diabetes and effect of insulin treatment on them. Methods: Insulin-dependent diabetes mellitus model were induced with a single intraperitoneal injection of streptozotocin (STZ, 60mg/kg). After model was made successfully, the diabetic model rats were divided into two groups (the diabetic model group and the insulin treatment group). In the second day, the insulin treatment group was injected subcutaneously with protamine zinc insulin once a day. The administration was ceased on the end of the second week, then the dorsal root ganglion of rats in each group were isolated and the total RNA was extracted by using Trizol reagent and the IGF-I and GAP-43 gene expression were detected by the method of RT-PCR. Results: The levels of IGF-I and GAP-43 mRNA were decreased obviously in early diabetic DRG (P<0.01), and insulin treatment could up-regulate the gene expression of IGF-I significantly (P<0.01) and had the tendency of increasing GAP-43 expression. Conclusion: The reductions of IGF-I and GAP-43 mRNA in DRG of early phase of diabetes may contribute to the pathogenesis of diabetic peripheral neuropathy. Key words Diabetes mellitus; IGF-I; GAP-43; Gene expression; Dorsal root ganglion; Rat 糖尿病外周神经病变（DPN）是糖尿病（DM）最常见的慢性并发症之一，是糖尿病患者致死致残的主要因素。其发病机制未完全清楚，目前认为它与血管障碍、代谢紊乱以及神经营养因子缺乏等因素有关。胰岛素样生长因子-I（insulin-like growth factor-I，IGF-I）为一种神经营养因子，对感觉、运动及植物神经具有营养作用，能促进神经的生长和修复，而生长相关蛋白43（growth associated proteim-43，GAP-43）被认为是神经生长的重要标志物，在神经损伤后的神经再生中起着非常重要的作用。相关文献报道，糖尿病神经病变的发生可能与IGF-I水平下降有关，与GAP-43水平的变化也有一定关系1，2。由于感觉异常往往是DPN的首发症状，在糖尿病状态下，背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）作为初级感觉神经元容易受损。糖尿病早期感觉神经元中IGF-I与GAP-43基因表达水平的变化如何，对于揭示DPN发病机制具有重要意义，但目前尚无相关文献报道。本研究应用RT-PCR技术观察糖尿病早期（2周）大鼠DRG中IGF-I与GAP-43基因的表达变化以及胰岛素对其的影响，从而探讨糖尿病早期神经病变发生的分子机制。 1 材料与方法 1.1 药品与试剂 链脲佐菌素（美国Sigma公司），精蛋白锌胰岛素注射液（上海第一生化药业有限公司），TRIzol Reagent（上海生工公司）。M-MLV逆转录酶、Oligo(dT)与dNTP（美国Promega公司）。DNA酶（Worthington公司原装）。Taq（加拿大BBI公司产品），DL-2000 DNA Marker（TaKaRa公司产品）。 1.2 模型制备 雄性SD大鼠30只,体重180220g，由南通大学实验动物中心提供, 禁食12h后,从中随机取22只大鼠，按60mg/kg体重给予一次性腹腔注射链脲佐菌素进行造模，余8只作为正常对照组，同时给予腹腔注射等体积的柠檬酸盐缓冲液。72h后,从大鼠尾静脉取血，邻甲苯胺法测定血糖,以非空腹血糖>16.0mmol/L视为糖尿病模型大鼠。最后成模大鼠为16只。 1.3 实验分组 将实验动物分为3组:正常对照组（8只）、模型动物按血糖高低随机分为模型组和治疗组（各8只）。治疗组在糖尿病模型造模成功后第2天开始每天皮下注射精蛋白锌胰岛素注射液(长效胰岛素,40U/ml),胰岛素用量根据血糖值调整,使大鼠非空腹血糖在3.910mmol/L之间，一般胰岛素用量为46U/d，造模成功后2周末时停止给药。正常对照组、模型组大鼠同时给予皮下注射相同容积的生理盐水。 1.4 大鼠背根神经节RNA提取和逆转录(RT) (1)提取总RNA:造模2周末时用TRIzol试剂按常规分别提取正常、模型与治疗组大鼠DRG的总RNA,测OD260、OD280值,计算RNA的浓度。总RNA用无RNA酶的DNaseI处理。并对总RNA进行甲醛变性胶电泳，检测其完整性。(2)合成cDNA第一链:参照Promega公司提供的逆转录酶使用说明书进行,逆转录反应体系25l:2g RNA(0.54l),1l Oligo(dT)15(0.5g/l),加入DEPC-treated水至12l,70 5min后骤冷,然后加入5l M-MLV 5Reaction Buffer,5l dNTPs，1l M-MLV逆转录酶(200U/l),加DEPC-treated水至25l,37 60min,然后70 10min停止反应。 1.5 聚合酶链反应(PCR) 根据GenBank数据库中提供的IGF-I、GAP-43和-actin基因(-肌动蛋白，管家基因)的全长cDNA序列,通过Primer3设计，由上海博亚生物技术有限公司合成IGF-I、GAP-43和-actin引物。见表1。 分别对治疗组、模型组与对照组的cDNA进行PCR扩增，以-actin作为内参。25l反应体系内包含cDNA 1l,10PCR Buffer 2l,上下游引物各10pmol,MgCl2 1.5mmol/L,dNTP各0.15mmol/L,TaqDNA聚合酶2U。使用PTC-100PCR仪(美国MJ.RESEARCH.INC.)进行扩增。IGFI与GAP-43基因的扩增条件为：94 4min，94 35s57 30s72 30s,循环29次后，于72 延伸7min，每管适时加入内参-actin引物，内参扩增25次。PCR产物在含溴化乙啶的2%琼脂糖凝胶上电泳分离。将凝胶置暗箱，使用小源凝胶分析系统拍照，获得凝胶电泳图像，使用Scion Image图像分析软件进行PCR产物条带分析。 1.6 统计学方法 为减少误差，以目的基因与内参的比值代替目的基因进行统计分析。实验数据用s表示，使用单因素方差分析,两两比较使用Scheffe检验统计，P0.01示差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 总RNA质量鉴定 OD260/OD280比值均在1.82.0之间,符合纯度要求。总RNA电泳检测结果显示RNA分子完整，无降解。如图1。 2.2 大鼠背根神经节IGF-I与GAP-43 mRNA表达 总RNA经RT-PCR后,于2%琼脂糖胶上电泳,结果见图2、3。结果见图2，3。将PCR产物条带进行扫描统计分析显示，IGF-I mRNA在对照组中相对表达量为0.690.06，在模型组中为0.360.11，在胰岛素治疗组中为0.610.12，GAP-43 mRNA在对照组中相对表达量为1.800.28，在模型组中为0.640.15，在治疗组中为0.910.18，对其进行统计分析，可见IGF-I和GAP-43 mRNA在糖尿病早期模型组大鼠DRG中的表达明显下调（P<0.01）,胰岛素治疗后能明显上调IGF-I的表达（P<0.01），对GAP-43的表达有上调趋势，但无统计学意义。见图4。 3 讨 论 IGFs即胰岛素样生长因子，近年研究发现其对感觉、运动及植物神经具有营养作用。IGFs包括IGF-I与IGF-。糖尿病的动物实验与临床实验均显示IGFs的表达水平降低。Ishii提出了关于糖尿病神经病变发病机制的假说：因胰岛素、IGF或IGF结合蛋白（IGFBP）、IGF受体及受体后的原因引起胰岛素、IGF作用降低，引起神经的营养支持减少导致糖尿病神经病变的发生1。已有相关文献报道，IGFs mRNA在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的外周神经、脊髓、肝脏及肾上腺中都显著减少2，而在早期糖尿病的感觉神经元中的IGFs的水平是否与其它组织中的表达一致，尚无相关文献报道。本实验结果发现IGF-I mRNA在链脲佐菌素诱导的糖尿病早期大鼠DRG中显著下调（P<0.01），而Craner3报道链脲佐菌素诱导的DM大鼠7周后，免疫细胞化学法显示小直径的DRG神经元中IGF-I蛋白水平显著下降。这说明糖尿病早期DRG即有IGF-I mRNA水平的显著下降，导致IGF-I的蛋白水平也随之下降。胰岛素治疗后能明显逆转IGF-I在糖尿病早期大鼠DRG中的表达变化（P<0.01），这提示，IGF-I表达下调不是由于链脲佐菌素毒性直接导致的，与胰岛受损也没有直接关联，推测可能与体内胰岛素降低、高血糖及由此引发的糖代谢紊乱或神经组织缺血缺氧有关。胰岛素可直接作用或通过控制血糖，减轻神经组织代谢紊乱或缺血缺氧来上调IGF-I的表达。 GAP-43即生长相关蛋白43（又名B50，F1，神经调素），在80年代初，发现它与神经发育、轴突再生、突触重建密切相关，被认为是神经元发育和再生的一个内在决定因子。有研究显示，在外周神经受损时，其受损神经与再生神经元中的GAP-43 mRNA水平都显著升高4，5,说明GAP-43在神经损伤后的神经再生中扮演极其重要的角色。而在DM状态下，其神经再生能力存在着缺陷，研究显示DM大鼠外周神经损伤后，其受损神经以及DRG中的GAP-43的表达均不能反应性上调，这可能是其神经轴突再生较缓慢的原因之一6，7。在糖尿病基础状态下，早期感觉神经元中的GAP-43的表达变化如何，尚无相关文献报道。实验发现在糖尿病早期（2周）大鼠DRG中GAP-43 mRNA的表达下降，差异有统计学意义（P<0.01），而胰岛素有上调其表达趋势。 本研究结果提示，在糖尿病早期，一方面，由于DRG中IGF-I水平下降，感觉神经元的营养支持减少，并由于神经内膜血流量的减少8，神经组织存在缺血损伤，致使感觉神经功能受损，而另一方面，作为神经元生长发育、神经再生的标志物GAP-43在感觉神经元中表达低下，这就可能导致受损神经不能有效地进行自我修复与再生，从而促进了糖尿病神经病变的发生。【参考文献】 1 Ishii DN. Implication of insulin-like growth factors in the pathogenesis of diabetic neuropathyJ. Brain Res Brain Res Rev, 1995, 20(1):47-67.2 Ishii DN, Guertin DM, Whalen LR. Reduced insulin-like growth factor-I mRNA content in liver, adrenal glands and spinal cord of diabetic ratsJ. Diabetologia, 1994, 37(11):1073-1081.3 Craner MJ, Klein JP, Black JA, et al. Preferential expression of IGF-I in small DRG neurons and down-regulation following injuryJ. Neuroreport, 2002, 13(13):1649-1652.4 丁 斐,崔学芝,顾晓松. 生长相关蛋白及其mRNA