胰腺癌组织细胞中胰腺炎相关蛋白的表达及意义.doc

胰腺癌组织细胞中胰腺炎相关蛋白的表达及意义 作者：王卫东 彭林 陈盛 孙建 【摘要】 目的 研究胰腺炎相关蛋白在人胰腺癌组织和胰腺癌细胞系中的表达，分析其同胰腺癌患者临床病理表现的关系，探讨其在胰腺癌诊断中的意义。方法 采用免疫组织化学染色和RT-PCR方法检测36例胰腺癌组织、28例胰腺炎组织、5例正常胰腺组织以及胰腺癌细胞系PANC-1中胰腺炎相关蛋白（Pancreatitis-Associated Protein PAP）的表达，分析其与胰腺癌患者临床病理指标的关系。结果 PAP在正常胰腺组织中完全不表达，在慢性胰腺炎组织中有一定表达（21.4%），在胰腺癌组织中表达明显（77.7%），在胰腺癌细胞系中亦有表达。胰腺癌组织中PAP的表达高于慢性胰腺炎和正常胰腺（P<0.01），胰腺癌的高表达与肿瘤周围淋巴结转移和远处转移有关（P<0.05）。结论 PAP在胰腺癌组织中的高表达可能对胰腺癌的诊断和预后判断有一定作用。 关键词 胰腺炎相关蛋白 胰腺癌 诊断 The expression of pancreatitis associated protein in the pancreatic carcinoma tissue 【Abstract】 Objective To investigate the expression of pancreatic associated protein（PAP）in the pancreatic carcinoma tissue and cell line by analyzing the relationship of PAP expression and the pathololgic marker and discussing the role of PAP in the diagnosis of pancreatic carcinoma.Methods Immuno-histochemistry stain and RT-PCR method were used to examine the expression of PAP in36pancreatic carcinoma tissue，28pancreatitis tissue and5normal pancreatic tissue.The PAP expression in the pancreatic carcinoma cell line PANC-1was also measured.Results PAP was not expressed in normal pancreatic tissue，but was found overexpressed in77.7%pancreatic carcinoma tissue and21.4%chronic pancreatitis tissue.The incidence.PAP overexpression was significantly higher on pancreatic carcinoma than that in the other pancreatic disease（P<0.01）PAP expression was correlated with nodal involvement and distant metastasis（P<0.05）.Conclusion PAP is overexpressed in the pancreatic carcinoma and may play a role in the tumor aggressiveness.PAP overexpression may be useful for the diagnosis and prognosis of pancreatic carcinoma. Key words pancreatitis associated protein pancreatic carcinoma diagnosis 胰腺癌的早期诊断和预后判断至今仍然是一项难题，对胰腺癌诊断有帮助的血清标志物如CEA、CA50、CA199等均有一定的作用，但灵敏性和特异性仍不满意而且无法判断胰腺癌的进展程度和预后。胰腺炎相关蛋白（PAP）是由胰腺细胞分泌的一种多肽，在正常胰腺细胞中几乎不表达但在胰腺炎时由胰腺细胞介导产生 12 。一般认为PAP与应激状态时细胞因子的产生如干扰素、肿瘤坏死因子、白细胞介素-6的产生有关 3。但PAP在胰腺肿瘤特别是胰腺癌中的表达尚不清楚。本实验检测了PAP在胰腺癌组织中的表达并分析了其与胰腺癌病理指标的关系。1 资料与方法 1.1 临床资料 36例胰腺癌组织标本取自我院19972001年手术切除患者，术后病理诊断均为胰腺导管腺癌。其中男27例，女9例，平均年龄58岁（4667岁）。术后证实5例合并周围淋巴结转移，6例有肝脏转移。病理分级:高分化10例、中分化8例、低分化18例。肿瘤直径:小于2cm者12例，26cm者15例，大于6cm者9例。5例正常胰腺标本取自胰腺外伤和胃癌联合胰腺部分切除患者。28例胰腺炎组织取自手术切除的慢性胰腺炎患者。手术切除标本立即置于-70保存，行冰冻切片，切片厚度4m，4%多聚甲醛固定。 1.2 细胞系培养 人胰腺癌细胞系PANC-1购自美国ATCC，培养于含20%胎牛血清的DMEM培养基中，并置于含95%O 2 ，5%CO 2 ，37培养箱中至肝癌细胞系呈对数生长期时应用。 细胞总RNA的提取:消化收集约10 7 个细胞用PBS缓冲液洗涤1次，向沉淀的细胞中加入1ml冰冷的变性液（Denaturing Solution）后，按照试剂盒说明书方法提取细胞总RNA。 1.3 RT-PCR检测 采用日本Takara公司一步法RT-PCR反应试剂盒。所用引物为5-3:GAAGACTCTCCGAAGAAAAATACCC;3-5:ACCTGTAAATTTGCAGAC-GTAGGG。制备PCR反应体系经50进行逆转录反应15min，94变性2min，然后进行由35次循环组成的扩增反应。每次循环包括:变性阶段94保持30s;退火阶段55，30s;延伸阶段72，90s。最后进行5min72延伸反应。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，用溴化乙锭染色后紫外灯下分析鉴定结果、照相。 1.4 免疫组化染色 采用SP法进行，第一抗体为PAP单克隆抗体，工作浓度140，由Santa Cruz公司提供。免疫组织化学染色步骤按SP试剂盒说明书进行，DAB显色，苏木素轻度复染，棕褐色为阳性染色。用PBS液代替第一抗体作空白对照，相同浓度小牛血清代替第一抗体作替代对照，结果均为阴性。显色标准分强阳性（阳性区域>50%），阳性（阳性区域30%50%），弱阳性（阳性区域10%30%）和阴性（阳性区域<10%）。 1.5 统计学方法 采用SAS统计分析软件行 2 检验，检验标准为0.05。2 结果 2.1 PAP基因表达情况 RT-PCR检测在正常胰腺细胞无PAP基因表达，在胰腺癌细胞系中可扩增出448bp的PAP基因片段。 2.2 免疫组织化学染色情况 正常胰腺组织为阴性表达，慢性胰腺炎组织为弱阳性或者阳性表达，阳性表达率为21.4%（6/28），而胰腺癌组织则为强阳性或阳性表达，阳性表达率为77.8%（28/36）。胰腺癌组织中的表达明显强于胰腺炎和正常胰腺组织（P<0.01）。 2.3 PAP表达和胰腺癌病理指标的关系 见表1。PAP的表达与胰腺癌的淋巴结转移、远处转移以及病理分级有密切关系，而与肿瘤大小、性别、年龄、肿瘤部位、有无黄疸、患者营养状况等临床指标无明显关系。 表1 PAP表达和胰腺癌病理指标的关系（略）3 讨论目前胰腺癌的诊断、治疗和预后均存在不少问题，临床确诊时患者往往已是中晚期，根治性手术切除率在25%以下，5年生存率和预后仍不容乐观。因此胰腺癌的早期诊断非常重要，临床预后的判断和合理的综合治疗是改善疗效的关键。对胰腺癌诊断有帮助的血清标志物如CEA、CA50、CA199等均有一定的作用，但灵敏性和特异性仍不满意而且无法判断胰腺癌的进展程度和预后。胰腺炎相关蛋白（PAP）是由胰腺细胞分泌的一种多肽，在正常胰腺细胞中几乎不表达但在急性胰腺炎时由胰腺细胞介导产生。一般认为PAP与应激状态时细胞因子的产生如干扰素、肿瘤坏死因子、白细胞介素-6的产生有关。但PAP在胰腺肿瘤特别是胰腺癌中的表达尚不清楚。本实验中笔者检测了胰腺癌组织和细胞系中PAP的表达，发现胰腺癌组织中PAP呈高表达且远高于慢性胰腺炎组织和其他组织，而且PAP的表达与病理分级、胰腺癌的淋巴结转移和远处转移密切相关，表明PAP可能对胰腺癌的诊断和预后判断有一定的价值。有报道显示胰腺癌患者血清中的PAP水平明显升高并且同血清CEA和CA199的水平呈一致变化，认为检测血清PAP的水平有助于胰腺癌的早期诊断 4 。笔者的结果支持这一观点，PAP作为一种应激因子，其产生受到多种细胞因子的调节，在胰腺炎是一种急性应激反应而在肿瘤形成则是由肿瘤本身产生或由相关肿瘤因子调节产生。虽然PAP产生的确切机制目前尚不清楚但在胰腺癌时其增高的程度明显高于其他疾病却是不争的事实。采用免疫组化方法和RT-PCR方法分别从蛋白水平和mRNA水平的检测均支持这一点。通过统计学的方法可以看出PAP的高表达预示着肿瘤淋巴结和远处转移的可能性较大，虽然目前没有患者生存时间和PAP表达之间关系的资料，但现有的资料显示PAP可能对胰腺癌患者的预后判断有一定帮助。笔者认为进一步研究PAP在胰腺癌发生、发展和转移过程中的作用，将有助于对胰腺癌患者的早期诊断和预后判断。 参考文献 1 KeimV，Iovanna JL，Dagorn JC.The acute phase reaction of the exocrine pancreas gene expression and synthesis of pancreatitis associated protein.Digistion，l994，55（2）:65-72. 2 Dusetti NJ，Frigerio JM，Fox FM，et al.Molecular cloning，genomic organization，and chromosomal location of the human pancreatitis associated protein gene.Genomics，1994，19（5）:108-114. 3 Dusetti HJ，Ortiz EM，Mallo GV，et a1.Pancreatitis associated protein，an acute phase protein induced