蛋白激酶C参与脂多糖诱导肺微血管内皮细胞VEGF表达.doc

蛋白激酶C参与脂多糖诱导肺微血管内皮细胞VEGF表达 作者：葛海燕，冯健，贲素琴，倪松石【摘要】 目的：观察蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）在内毒素/脂多糖（lipopolysacchride， LPS)诱导血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）表达上调中可能发挥的作用。方法：以肺微血管内皮细胞为研究对象，用PKC抑制剂预处理内皮细胞，以RT-PCR检测VEGF mRNA水平的表达变化；Western Blot检测其蛋白质水平的表达变化。结果：(1)VEGF mRNA的表达水平与LPS呈剂量和时间依赖的关系；（2）PKC抑制剂calphostin c预处理内皮细胞能显著抑制LPS诱导VEGF mRNA和蛋白的表达。结论：LPS可能通过PKC信号通路而诱导肺微血管内皮细胞VEGF表达上调。 【关键词】 脂多糖 蛋白激酶C 肺血管内皮细胞 血管内皮细胞生长因子Abstract Objective: To investigate whether lipopolysacchride（LPS）-induced vascular endothelial growth factor (VEGF) expression was mediated by protein kinase C（PKC）. Methods: The rat pulmonary microvascular endothelial cells (RPMVECs) were challenged with LPS before PKC inhibitor(calphostin c) or vehicle, the levels of VEGF mRNA were assayed by RT- PCR, and the levels of VEGF protein were assayed by Western Blot. Results: LPS induced VEGF expression at time and dose dependent manner in RPMVEC. Pretreatment of these cells with the PKC inhibitor(calphostin c) markedly inhibited the LPS-induced VEGF expression. Conclusion: LPS may induce VEGF expression in RPMVEC mediated in part by PKC signal pathway.Key words Lipopolysaccharide; Protein kinase C; Pulmonary microvascular endothelial cell ; Vascular endothelial growth factor血管内皮细胞(vascular endothelial cell, VEC)处在血液与血管平滑肌细胞之间,能分泌多种生理活性物质,调节血管功能，血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF) 即为其中之一。VEGF 具有促进VEC分裂、诱发新血管形成及增加血管通透性的作用1,2。本文以培养的肺微血管内皮细胞为模型, 以细菌脂多糖(lipopolysacchride, LPS) 为诱导因素,从VEGF和蛋白激酶C（protein kinase c, PKC）着手，以阐明其发生机制。1 材料和方法1.1 材料 LPS（Escherichia coli,0111:B4), calphostin C均购自Sigma公司，DMEM培养基和Trizol 试剂购自Gibco BRL公司，小牛血清购自Hyclone公司，细胞培养板购自Corning公司，VEGF多克隆抗体购自Santa Cruz公司，ECL Western 检测系统购自Cell Signal公司；PCR逆转录试剂盒购自Fermentas MBI公司。1.2 方法1.2.1 大鼠肺微血管内皮细胞分离培养和处理 大鼠肺微血管内皮细胞的分离,培养参照Chen等的方法3，将新生1 d的SD仔鼠处死，乙醇浸泡消毒5 min，取出肺组织用PBS冲洗，将肺的周边切割成1 mm1 mm1 mm大小组织块，用吸管将组织块均匀放置在培养瓶内，间距约1 cm。加入含10胎牛血清、105 U/L青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM培养基，放入37 、含5CO2、湿度为95100的孵箱内，静置培养60 h后去除组织块。34 d更换1次培养液。第12周8090细胞单层汇合时，用0.5%胰蛋白酶消化后按13传代。实验用25代细胞。相差显微镜下，细胞呈典型的铺路石状排列，采用CD31抗原间接免疫荧光染色进行鉴定。实验开始前细胞无血清培养24 h。实验细胞分为：(1)正常对照组和用不同浓度LPS刺激内皮细胞24 h，分别测定VEGF mRNA和蛋白的表达；(2)正常对照组和100 ng/ml LPS刺激内皮细胞6 h、12 h、24 h、36 h和48 h，分别测定VEGF mRNA和蛋白的表达；(3)正常对照组和用终浓度分别为0.011 mol/L的calphostin c预处理内皮细胞30 min后，用LPS刺激内皮细胞24 h，分别测定VEGF mRNA和蛋白的表达。1.2.2 RT-PCR 应用Trizol Reagent从各组内皮细胞中提取总RNA。以Oligo (dT) 为引物,遵循RNA逆转录试剂盒操作步骤合成dscDNA。根据VEGF(Genebank: AF062644)基因序列,用primer premier软件设计的PCR 反应体系中的上下游引物,分别为：上游引物为:5- CACATAGGAGAGATGAGCTTC-3下游引物为:5-TCGTCACCGTCGACAGAACAG -3扩增产物400 bp, GAPDH上下游引物分别为：上游引物为:5-GAAACTACCTTCAAC TCCATC-3下游引物为:5-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3扩增产物250 bp，以逆转录反应的产物dscDNA 为模板进行扩增，反应参数为:94 变性30 s，55 退火1 min，72 延伸1 min，共25 循环，最后于72 继续保温5 min，反应产物以1 %琼脂糖凝胶电泳鉴定。反应结束后,取PCR 反应液(10 l) 进行琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪上观察结果。1.2.3 Western Blot 细胞培养至相应的时间后弃去培养液提取蛋白并用改良Lowry法进行蛋白定量，从相应蛋白样品中取等量的蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离的蛋白质转印至PVDF膜后，在5%脱脂奶粉封闭液中室温封闭1 h。随后以抗VEGF(11000稀释)孵育过夜。1PBST洗涤3次后加入相应的二抗孵育2 h。洗涤后以ECL检测，通过X胶片感光而获得蛋白信号。-actin作为内参。2 结 果2.1 LPS诱导内皮细胞VEGF的表达2.1.1 LPS诱导内皮细胞VEGF表达的剂量依赖性不同剂量LPS刺激内皮细胞24 h后，随着LPS剂量的升高，VEGF mRNA表达的相对量亦逐渐升高（图1A）。10、100、1000 ng/ml LPS处理组VEGF mRNA表达量高于对照组。VEGF蛋白质表达变化与mRNA表达变化相一致，LPS上调VEGF蛋白表达呈时间依赖关系（图1B）。2.1.2 LPS诱导内皮细胞VEGF表达的时间依赖性100 ng/ml LPS刺激内皮细胞后，VEGF mRNA表达相对量逐渐升高，LPS 24 h处理组VEGF mRNA表达量达到峰值（图2A）；LPS 刺激36 h后VEGF mRNA表达相对值开始下降。VEGF蛋白质表达变化与mRNA表达变化相一致，LPS上调VEGF蛋白表达呈时间依赖关系（图2B）。2.2 PKC参与LPS诱导内皮细胞VEGF的表达 用0.011 mol/L calphostin C预处理内皮细胞，其以剂量依赖的方式抑制LPS所诱导的VEGF mRNA和蛋白质表达增加，这提示LPS通过调节PKC信号通路而调节VEGF表达增加（图3）。3 讨 论VEGF 是一种能与肝素结合的分子量为3446 kD 的多肽血管生长因子。VEGF 是一高度特异的血管内皮有丝分裂素,具有双重功能: (1) 增加微血管通透性,促进血浆纤维蛋白外渗; (2) 通过与内皮细胞上两个VEGF 受体Flt1 (fms 样酪氨酸激酶) 和flk(胎肝激酶) 作用,直接刺激内皮细胞增殖，并促进内皮细胞移位,有利于炎症细胞向邻近结缔组织基质扩散,在炎症的发生和发展中发挥了重要作用4,5。本文利用LPS为诱导剂来刺激PMVEC ,结果表明:正常PMVEC 仅有微量的VEGF的基础表达,LPS 的刺激能显著促进PMVEC 表达VEGF,呈现时间剂量依赖方式。提示可能是由于内毒素致伤后,通过某种途径或因素促进了PMVEC VEGF的表达,从而为血管通透性增加提供了物质基础,也是PMN大量于肺内扣押及肺组织广泛损伤的前提。对于LPS引起VEGF表达调控的机制，Ramanathan等报道LPS介导VEGF的表达是NF-B依赖的。LPS通过与Toll样受体（toll-like receptor 4,TLR-4）结合，激活TNF受体相关因子-6（tumor necrosis factor associated factor-6, TRAF-6）,TRAF-6又激活下游的NF-B诱导激酶（NF-B-inducing kinase，NIK），它们又激活I-B磷酸激酶，引起I-B磷酸化而降解，从而引起NF-B的转核活化6。PKC是细胞内重要的信号转导通路，可把细胞外刺激转到细胞内，引起核反应，在细胞的增殖、分化和应激的调控中起重要作用。已有研究表明PKC激动剂佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA）能显著增加内皮细胞VEGF的表达，而抑制PKC的活性能逆转PMA所诱导的VEGF表达7。PKC可能通过增加VEGF mRNA的稳定性上调VEGF的表达。此外，也有研究发现LPS刺激内皮细胞PKC活化而调节细胞通透性改变8，那么PKC是否参与了LPS诱导VEGF的表达调控，文献报道较少。本研究结果发现，calphostin C可显著抑制LPS诱导的RPMVEC VEGF mRNA和蛋白的表达，这说明LPS介导的VEGF的转录和翻译至少可部分通过PKC途径实现。Calphostin C是非特异性PKC抑制剂，所以需进一步研究LPS通过某个或几个特异性PKC亚型发挥作用，这也揭示阻断异常的PKC信号通路可能成为防治内毒素休克时血管内皮损伤的新途径，PKC也可作为一个治疗的分子靶点，来控制细菌感染所致败血症、感染性休克和多器官功能不全综合征。【参考文献】 1 Gavard J, Patel V, Gutkind JS. Angiopoietin-1 prevents VEGF-induced endothelial permeability by sequestering Src through mDiaJ. Dev Cell, 2008,14(1):25-36.2 Yamazaki Y, Nakano Y, Imamura T, et al. Augmentation of vascular permeability of VEGF is enhanced by KDR-binding proteinsJ. Biochem Biophys Res Commun, 2007,355(3):693-699. 3 Cheng C, Liu H, Ge H, et al. Lipopolysaccharide induces expression of SSeCKS in rat lung microvascular endothelial cellJ. Mol Cell Biochem, 2007, 305(1-2):1-8.4 Yamagata M, Rook SL, Sassa Y,et al. Bactericidal/permeability-increasing proteins signaling pathways and its retinal trophic and anti-angiogenic effectsJ. FASEB J, 2006,20(12):2058-2067.5 McCourt M, Wang JH, Sookhai S,et al. Proinflammatory mediators stimulate neutrophil-directed angiogenesisJ. Arch Surg, 1999, 134(12):1325-1332.6 Ramanathan M, Pinhal-Enfield G, Hao I,et al.Synergisti