诱生型一氧化氮合酶在白色和杂色豚鼠脉冲噪声损伤耳蜗中的表达.doc

诱生型一氧化氮合酶在白色和杂色豚鼠脉冲噪声损伤耳蜗中的表达 作者：何青莲 ,熊敏,李云英石灵春 ,谭敏,李华【摘要】 【目的】 观察诱生型一氧化氮合酶(iNOS)在脉冲噪声暴露白色和杂色豚鼠耳蜗中的表达,以探讨黑色素对耳蜗损伤的保护作用机理。【方法】将白色和杂色豚鼠暴露于脉冲噪声,复制耳蜗损伤的模型。采用免疫组织化学的方法观察iNOS在两组豚鼠耳蜗的表达。 【结果】iNOS在两组脉冲噪声暴露豚鼠耳蜗中均呈阳性表达,以血管纹和螺旋神经节的表达较强,而且iNOS在白色豚鼠耳蜗的表达显著强于杂色豚鼠。【结论】耳蜗黑色素拮抗耳蜗损伤的作用可能是通过抑制耳蜗iNOS表达来实现的。 【关键词】 耳蜗/损伤;耳蜗/病理学;脉冲噪声;黑色素;疾病模型，动物;豚鼠一氧化氮(nitric oxide, NO)有多种生物学作用,由L精氨酸在一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase, NOS)的催化作用下产生。有研究表明诱生型NOS(iNOS)参与噪声的耳蜗损伤机制1,而黑色素对杂色豚鼠耳蜗的损伤有拮抗作用2。目前有关黑色素拮抗豚鼠耳蜗损伤的机理尚不清楚3,本研究应用免疫组织化学方法观察iNOS在脉冲噪声暴露损伤白色和杂色豚鼠耳蜗的表达,以探讨黑色素是否通过抑制iNOS的表达而拮抗耳蜗损伤。现报道如下。1材料与方法11实验动物选用健康白色红目豚鼠(白色组)和杂色豚鼠(杂色组)各8只,耳镜检查鼓膜正常,耳廓反射灵敏。豚鼠来源于广东省医学实验动物中心,3月龄,体质量250 g左右,雌雄兼用,合格证号：0017410。12主要试剂与仪器抗iNOS抗体、链酶亲和素生物素过氧化物酶复合物(SABC)免疫组化试剂盒(SA1022)均为Sigma公司产品。86式自动步枪来源于广东省军区军训靶场，Pathfinder I型听功能测试仪(Nicolet公司)。13造模方法4-5脉冲噪声发生源为86式自动步枪,脉冲噪声发生环境为军训靶场,将豚鼠置于距步枪口15 cm处,测得该处声压为170 dB。步枪连续激发6发,每次激发间隙10 s。14听觉脑干诱发电位(ABR)检测ABR阈值采用听功能测试仪记录,短声刺激,声音由耳机通过与豚鼠外耳道耦合的塑料小管输入,以第3波为基准测反应阈,测定脉冲噪声暴露前后听阈值。两组豚鼠在脉冲噪声暴露前及暴露后24 h行ABR检测。15取材最后1次检测ABR后,豚鼠在全麻下开胸,以磷酸盐缓冲液(PBS)心脏灌流,在灌流液清亮时,改用40 g/L多聚甲醛灌注固定5 min。迅速取下双侧颞骨,将耳蜗置于4、40 g/L多聚甲醛液中,在解剖显微镜下摘除镫骨,用细针于蜗顶钻一小孔,轻轻以40 g/L多聚甲醛灌流耳蜗,耳蜗在40 g/L多聚甲醛固定12 h以上,PBS漂洗数次,100 g/L乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙,石蜡包埋,切片,每片厚度6 m。16免疫组织化学染色两组豚鼠耳蜗切片以二甲苯及酒精脱石蜡后,Tris缓冲盐溶液(TBS)漂洗10 min3次,体积分数2%双氧水处理20 min。TBS漂洗10 min2 次后,2 g/L Triton处理10 min。TBS漂洗10 min2次,50 g/L胎牛蛋白封闭60 min。加抗iNOS抗体(以8 g/L胎牛蛋白稀释为1800,Sigma公司,从兔血清制备)，在4冰箱过夜。加入二抗(羊抗兔, 用TBS稀释为1400)1 h,TBS漂洗后加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(StrepHRP,用TBS稀释为1100)1 h,TBS漂洗10 min4次后,用二氨基联苯胺(DAB)显色液显色,显色在光镜下控制进行。阴性对照以8 g/L胎牛蛋白代替抗iNOS抗体,以庆大霉素损伤豚鼠肾脏切片为阳性对照。iNOS在两组豚鼠耳蜗的表达强度以+表示进行半定量分析6。17统计学方法采用SPSS 115软件进行数据的统计学分析。2结果21两组豚鼠ABR听阈变化由表1可知,两组豚鼠在脉冲噪声暴露后ABR比较差异具有显著性意义(P<001),杂色豚鼠的平均听阈比白色豚鼠约低17 dB左右。表1两组豚鼠ABR听阈变化比较22两组豚鼠耳蜗iNOS表达比较iNOS在两组豚鼠耳蜗反应均呈阳性,而且在耳蜗的各转都呈阳性,iNOS在白色豚鼠耳蜗的表达明显强于杂色豚鼠。在Corti氏器,支持细胞如：Hensen细胞、Deiter细胞、内外柱细胞、边缘细胞iNOS反应均呈阳性。感觉细胞(内、外毛细胞)iNOS染色呈阳性,外毛细胞染色较强,内毛细胞染色较弱。蜗神经的iNOS染色在光镜下呈阴性。图1结果显示：白色豚鼠耳蜗血管纹和螺旋神经节细胞iNOS反应均呈强阳性 (图1-a,b),杂色豚鼠耳蜗血管纹和螺旋神经节细胞iNOS反应均呈弱阳性 (图1-c,d)。iNOS在两组豚鼠耳蜗的表达强度见表2。表2两组豚鼠iNOS耳蜗表达强度比较3讨论噪声能导致耳蜗的损伤,噪声引起耳蜗的损伤包括机械性和代谢性两种机制,一般认为先有机械性损伤,之后继发代谢性损伤。杂色豚鼠耳蜗黑色素能拮抗噪声对耳蜗的损伤作用,但是黑色素拮抗耳蜗损伤的作用机理不清楚3。研究证实iNOS是参与噪声耳蜗损伤的主要病理因素之一1。本研究结果表明在脉冲噪声损伤时iNOS在杂色豚鼠耳蜗的表达强度显著低于白色豚鼠耳蜗的强度,证明杂色豚鼠耳蜗黑色素通过代谢途径抑制iNOS活性,从而拮抗豚鼠耳蜗的损伤。iNOS在脉冲噪声损伤耳蜗中表达阳性,尤以血管纹和螺旋神经节细胞为甚。iNOS在正常的组织中不表达,一旦在病理因素的刺激下表达则持续催化产生大量NO7,而大量NO则对组织产生损伤作用。另外,NO与过氧化物反应产生过氧亚硝酸盐8-9,过氧亚硝酸盐能迅速解离氢氧根自由基,亦导致细胞损伤。同时,NO能激活N-甲基-D-天冬氨酸受体的负反馈机制,而导致内耳的神经阻滞10。豚鼠耳蜗在暴露脉冲噪声后血管纹和螺旋神经节iNOS的表达较强,从而产生大量NO而损伤血管纹和螺旋神经节细胞。血管纹是整个耳蜗包括内外毛细胞及支持细胞能量的主要来源11,血管纹的损伤导致耳蜗功能的失调。螺旋神经节细胞是听觉传导路的一级神经原,其损伤导致听觉传导的阻滞。综上所述,脉冲噪声能引起耳蜗iNOS的表达,而杂色豚鼠耳蜗黑色素通过代谢途径抑制iNOS活性,从而拮抗脉冲噪声耳蜗的损伤。【参考文献】 1Shi X, Nuttall A l. Upregulated iNOS and oxidative damage to the cochlear stria vascularis due to noise stressJ.Brain Res,2003,967(1-2)：1.2 朱明,黄以乐,龙孝斌,等。内耳色素与爆震性听损伤J听力学及言语疾病杂志,2000,8(3)：140.3 Bartels S, Ito S, Trune D R, et al. Noiseinduced hearing loss: the effect of melanin in the stria vascularisJ. Hear Res, 2001,154(1-2),116.4Sendowski I, Abaamrane L, Raffin F, et al. Therapeutic efficacy of intracochlear administration of methylprednisolone after acoustic trauma caused by gunshot noise in guinea pigsJ. Hear Res, 2006, 221(1-2):119.2010年第27卷广州中医药大学学报5 Sendowski I, Raffin F, Braillon Cros A. Therapeutic efficacy of magnesium after acoustic trauma caused by gunshot noise in guinea pigsJ. Acta Otolaryngol, 2006, 126(2):122.6于萍,步宏,王华,等. 免疫组化结果的图像分析与人工计数方法的对比研究J. 生物医学工程杂志, 2003,20(2):288.7 Cattell V. Nitric oxide and glomerulonephritisJ. Semin Nephrol, 1999, 19: 277.8 Huie R E, Padmaja S. The reaction of NO with superoxideJ. Free Rad Res Commun, 1993, 118: 195.9 Cayevieille C, Muller A, Meynier F, et al. Superoxide and nitric oxide cooperation in hypoxia/reoxygeneration induced neuron injuryJ. Free Rad Biol Med, 1993, 14: 389.10Soto E, Flores A, Erostegui C, et al. Evidence for NMDA receptor in the afferent synaptic transmission of the vestibular systemJ. Brain Res, 1994, 633: 289.1