阪崎肠杆菌研究进展.ppt

中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌研究进展,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所 赵贵明 2009年8月,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,内容提要,第一部分：阪崎肠杆菌的分类学变化 第二部分：阪崎肠杆菌检验研究进展,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌的重视程度,CODE OF HYGIENIC PRACTICE FOR POWDERED FORMULAE FOR INFANTS AND YOUNG CHILDRENCAC/RCP 66 - 2008替代 CAC/RCP 21-1979 由争论到定论 给出了制定阪崎肠杆菌监控计划的指南,脑膜炎,小肠结肠炎,菌血症,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,我国对阪崎肠杆菌方面的管理规定,关于对进口乳制品进行阪崎肠杆菌检测的通知(国质检食函2005690号)； 关于加强进口乳制品检验检疫监督管理工作的通知国质检食函2007298号）； 婴幼儿配方乳粉生产许可证审查细则(2006、2008版),中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌对配方粉的污染点、存活时间和传播线路,监控时间：2005.42006.3 分离出阪崎肠杆菌：80株 中间产品和终产品的阳性检出率：2.5% 阳性样品检出点占全部取样点的比例：31%,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,第一部分：阪崎肠杆菌的分类学变化,阪崎肠杆菌分类学及命名的发展历史 阪崎肠杆菌的发现及其命名历史 阪崎肠杆菌为新种的分类依据 克罗诺杆菌分类学、词源学及其属和种生物学特性 克罗诺杆菌（Cronobacter spp.）属名、种名词源学 属及其各个种的生物学特性、代表性种,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌分类学及命名的发展历史,阪崎肠杆菌的发现及其命名历史 1929年Pangalos报道的一种引起婴儿败血症的产黄色素的大肠菌，称为“黄色大肠菌、黄色肠杆菌”; 1961年Urmenyi和Franklin根据1958年发生在英国奥尔本的两例新生儿死亡病理研究，在报道中描述了其病因源于一种少见的产黄色素的阴沟肠杆菌菌群，并取日本细菌学家Riichi Sakazaki的名字作为该菌的名称;有人称之为：“Urmenyi和Franklin杆菌”； 1965年Joker等分析了发生在丹麦的一个相同病例，并报道该种菌可导致新生儿脑膜炎并产生神经损伤，根据两起报道首次明确了该种病原菌为“非典型的产黄色素的阴沟肠杆菌”. 直到1980年，Farmer等发表了题为“Enterobacter sakazakii, new species of Enterobacteriaceae isolated from clinical specimens.”的文章，该菌才被统一命名并定义，该篇文章是对阪崎肠杆菌研究的阶段性成果总结。,阴沟肠杆菌,阪崎肠杆菌,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌为新种的分类依据 统一了该菌的名称； 确证了“产黄色素的阴沟肠杆菌”是一个新种，而不是阴沟肠杆菌的一个生物群。 依据什么？ DNA相关性 产黄色素 生化试验 抗生素易感性,细菌不同株属于同一种水平DNA的相关性通常应在70%或更高,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,DNA相关性实验,ATCC29544,阴沟肠杆菌,差异柠檬酸杆菌,51%,51%,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,生化试验,不利用山梨醇 36C下培养7d，DNA酶为阳性,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,Farmer实验结论,阪崎肠杆菌与阴沟肠杆菌不是同一个种； 阪崎肠杆菌生化反应与肠杆菌属细菌更为相近； 阪崎肠杆菌应作为一个独立种，归属于肠杆菌属，鉴于所分离出的阪崎肠杆菌之间也有差异，被分成15个生物型或群。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,细菌分类方面的问题,种是生物分类中基本分类单位，是具有高度特征相似性的菌株群，该菌株群与其它类群的菌株有很明显的区别； 细菌学家和分类学家存在一定分歧； DNA杂交同源性在60-70%以上，或16SrRNA序列同源性达到97%以上的菌株，被认为是同一种。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌的分类学变化,16SrRNA序列同源性在细菌分类学上的重要作用,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌重新分类的依据及结果,重新分类的依据： 的扩增片段长度多态性分析（Amplified fragment length polymorphismas, AFLP） 16S rRNA全序列比较 DNA- DNA杂交实验结果。 2008年Iversen等在记录新细菌类群包括分类、命名、鉴定和系统发育的官方杂志“国际期刊系统与进化微生物学（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, IJSB）”上发表文章。 建议将阪崎肠杆菌重新分类命名，成为肠杆菌科1个新属，即克罗诺杆菌属（Cronobacter spp.）包括5个新种（其中Cronobacter sakazakii称为新组合）、1个克罗诺杆菌基因种（genomospeciese）和三个新亚种，在该杂志通知清单上（2008年，58卷，第6部分）1个新属、5个新种和三个新亚种已公布。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,“系统与进化微生物学国际期刊（International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, IJSB）”,记录新细菌类群包括分类、命名、鉴定和系统发育的官方杂志,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,包括5个新种,（其中Cronobacter sakazakii称为新组合）、1个克罗诺杆菌基因种（genomospeciese）和三个新亚种.,克罗诺杆菌属（Cronobacter spp.）,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,DNA相关性：同种70%；其它70%；支持克罗诺杆菌应由不同种组成的说法,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,克罗诺杆菌及相近种细菌的16SrRNA基因进化树,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,克罗诺杆菌属（Cronobacter spp.）,Cronobacter sakazakii，仍以日本细菌学家名字命名，中文应为阪崎克罗诺杆菌； Cronobacter malonaticus，“malonaticus”意为可利用丙二酸盐，中文应为丙二酸盐阳性克罗诺杆菌； Cronobacter turicensis，“turicensis”是瑞士苏黎世的拉丁文名字，中文应为苏黎世克罗诺杆菌； Cronobacter muytjensii，“muytjensii”即Muytjens，是荷兰著名微生物学家，早期从事过大量阪崎肠杆菌方面的研究工作，中文穆汀斯克罗诺杆菌； Cronobacter dublinensis，都柏林克罗诺杆菌，菌株的分离地点， Cronobacter dublinensis subsp. dublinensis，都柏林克罗诺杆菌都柏林亚种； Cronobacter dublinensis subsp. lausannensis，都柏林克罗诺杆菌洛桑亚种； Cronobacter dublinensis subsp. lactaridi，都柏林克罗诺杆菌乳粉亚种，“lactaridi”意为乳粉或奶粉。 一个克罗诺杆菌基因种1，Cronobacter genomospecies 1。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,克罗诺杆菌词源学,名字起源于希腊神话中“Cronos”，克罗诺斯是十二个泰坦巨神之一，传说中的天空间神，当他每个孩子一出生就被他一口吃掉，行为表现形式和该菌的致病特性很吻合，因此，笔者建议将Cronobacter spp.中文翻译成“克罗诺杆菌属”。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,克罗诺杆菌属生物学特性,革兰氏阴性杆菌 氧化酶阴性 触酶反应阳性 兼性厌氧 通常有动力 3m1m,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,生长条件范围,6C -45C下可以在BHI中生长； pH5-10可以生长，低于4.5不生长； 0-7%的NaCI中生长；超过10%不生长； 100mM硫酸铵，硝酸钠、亚硝酸钠中仍可生长； 200mM磷酸钠，5%硫酸钠和20%乙二醇中也可生长； 20mM苯甲酸钠中不生长。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,糖醇利用,还原硝酸盐 利用柠檬酸盐 水解七叶苷 水解精氨酸 鸟氨酸 脱羧酶阳性 产酸 葡萄糖、蔗糖、棉子糖、蜜二糖 、纤维二塘、甘露醇、甘露糖、鼠李糖、阿拉伯糖、海藻糖半乳糖醛酸酯(盐) 、麦芽糖。 VP阳性 甲基红阴性,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌主要生化特征,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,克罗诺杆菌不同种和亚种的生化反应,吲哚 卫矛醇 果糖 丙二酸盐 麦芽糖 帕拉金糖 丁二胺 松三糖 松二糖 肌醇 乌头酸盐 甲基-葡萄糖苷 氨基丁酸,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,简单区分各种的生化反应,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌的检测方法,FDA ，Isolation and Enumeration of Enterobacter sakazakii from Dehydrated Powdered Infant Formula 2002 SN/T 16322005 奶粉中阪崎肠杆菌检验方法 SN/T 1632.12005 分离与计数方法 SN/T 1632.22005 PCR检验方法 SN/T 1632.32005 荧光PCR检验方法 ISO/TS 22964 IDF/RM210 Milk and milk products Detection of Enterobacter sakazakii 2006 GB/T 4789.402008 食品卫生微生物学检验 阪崎肠杆菌检验 第一法 定性方法 第二法 MPN方法,Keith Lampel 基思.蓝佩尔,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,阪崎肠杆菌检测方法的实验设计,传统方法 前增菌 蒸馏水 BPW 选择性增菌 mLST EE 选择性分离 显色培养基（DFI、ESIA，其他） VRBGA 主要生化特征的鉴别 产黄色素 DNA酶 生化鉴定 API VITEK 其他,分子生物学方法 前增菌 选择性增菌 目标片段扩增 dnaG.基因，大分子合成操纵子； gluA.基因，-葡萄糖苷酶； rpob基因，编码RNA聚合酶亚单位的基因 分离 鉴定,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,增菌过程发现的问题,EE肉汤抑制了部分肠杆菌属细菌生长，包括阪崎肠杆菌； 当含量低的目标菌被有效回收时，竞争性的革兰氏阳性菌也能检测的到； 提出在前增菌的BPW中增补： 40M8-羟基喹啉、0.5g柠檬酸鉄铵、0.1g去氧胆酸钠、0.1g丙酮酸钠,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,分离克罗诺杆菌新筛选方法,FDA方法： ISO/TS 22964: CSB增菌肉汤结合DFI琼脂：,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,CSB克罗诺杆菌筛选肉汤（g/L）,蛋白胨 10； 肉浸粉 3； 氯化钠 5； 溴甲酚紫 0.04； 蔗糖 10； 万古霉素 10mg； pH7.40.1 最佳培养温度：42C,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,两种显色培养基的成分差别,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,底物的种类和特点,荧光类 水溶性；受pH值影响；强烈扩散；需紫外灯 吲哚类（吲哚衍生物）（新型酶底物） 稳定性好；5-Br-4-Cl-3-吲哚（X）：蓝绿色 5-Br-6-Cl-3-吲哚（Y）：洋红色 6-Cl-3-吲哚：鲜肉色 6-F-3-吲哚：胭脂红 酚类 如：儿茶酚，苯磷二酚 其他 间接反应,直接反应,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,克罗诺杆菌表型特征和遗传特征试验的结果区别,X-Glu，0.1g/L,3.8%克罗诺杆菌在显色培养基为阴性，当增加到0.15g/L时，又可以变成蓝绿色菌落； 肠杆菌科其他菌32%-46%也是阳性。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,表型和遗传试验鉴定克罗诺杆菌的结果差异评价,底物反应比商品化显色培养基灵敏度更高，尤其是Cronobacter sakazakii和Cronobacter dublinensis； -葡萄糖苷酶并非100%都能表达，传统反分离方法存在漏检可能0.5-4.3%； 通过遗传特征的鉴定效率更高一些； API20E鉴定克罗诺杆菌属的符合率（从好的鉴定到最好的鉴定）仅70%；,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,根据rpoB基因设计的引物可以将克罗诺杆菌属各种区分开,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,建议重新修订阪崎肠杆菌行业标准,阪崎肠杆菌的命名及分类学方面已产生变化 国标没有快速筛选方法 附录中增加阪崎肠杆菌可以鉴定到种的方法,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,影响乳粉安全的食源性致病菌研究,背景： 乳粉作为一种特殊食品，近年来连续引发了与安全相关的事件而受到国际相关组织、各国政府的高度重视及国民的广泛关注，但现行的乳粉卫生标准已不能够满足乳粉安全的要求，开展影响乳粉安全的食源性致病菌方面的研究急需而紧迫。 获得的资助： 科技部社会社会公益研究专项“乳粉中新出现的致病菌研究及其风险评估” (2004DIA2J004) ； 国家质检总局“乳品中阪崎肠杆菌检测方法研究” （2004IK097）的资助。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,研究成果,应用分子生物学手段和对传统方法进行创新性改进技术，形成了对肺炎克雷伯氏菌等16种潜在致病菌的检测方法体系； 制订了乳粉卫生微生物学检测方法13项行业标准、10项进出口婴幼儿配方粉柠檬酸杆菌等计数与检测方法国家标准； 对乳粉中16种潜在致病菌进行了风险评估； 首次对我国进口及进口原料生产的487份奶粉样品中阪崎肠杆菌污染状况进行了调查。 发表文章47篇；申请专利1项。,中国检验检疫科学研究院食品安全研究所,对阪崎肠杆菌的分