重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转染EMT6细胞株的筛选.doc

重组HER2真核表达载体的构建及其稳定转染EMT6细胞株的筛选 作者：徐腾飞, 张文卿, 于红, 李丹【摘要】 目的: 构建人表皮生长因子受体（HER2）胞外区（1 896 bp）基因的真核表达质粒（pcDNA6/v5hisHER2）, 转染小鼠乳腺癌细胞（EMT6）, 获得其稳定表达细胞株(EMT6/ HER2)。方法: 用PCR方法从含HER2全长基因的pcDNA3.1HER2质粒上扩增HER2胞外区基因序列; 经酶切、 连接构建pcDNA6/v5hisHER2; 转化大肠杆菌DH5, 筛选阳性克隆, 对其进行酶切及测序鉴定; 以PEI法将pcDNA6/v5hisHER2导入EMT6小鼠乳腺癌细胞, 经杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选12周, 获得抗性克隆EMT6/HER2; 用RTPCR检测EMT6/HER2中HER2 mRNA, 免疫组化法检测其HER2蛋白的表达。结果: PCR产物与预期片段大小一致; pcDNA6/v5hisHER2经酶切、 琼脂糖凝胶电泳后, 可见与PCR产物大小相同的片段; DNA测序结果显示, pcDNA6/v5hisHER2 中HER2 基因序列无误, 读码框正确; 用RTPCR可在EMT6/HER2中检测到HER2 mRNA, 免疫组化法证实, EMT6/HER2中有HER2的阳性信号。结论: 成功地构建了HER2胞外区真核表达载体, 获得稳定表达HER2基因的小鼠乳腺癌EMT6细胞株, 为进一步研究HER2基因过表达与乳腺癌发生的关系及其基因治疗奠定基础。 【关键词】 HER2; 真核表达; 转染AbstractAIM: To construct an eukaryotic vector encoding extracellular domain of human epidermal growth factor receptors (HER2), pcDNA6/v5hisHER2, and to screen HER2 positive clones from mouse breast cancer cell line EMT6. METHODS: The extracellular domain of HER2 was amplified from pcDNA3.1HER2 by PCR. pcDNA6/v5hisHER2 was prepared by inserting the fragment into the plasmid pcDNA6/v5his. Then the recombinant vector was identified by restriction enzyme and sequencing. Next, pcDNA6/v5hisHER2 was transfected into the EMT6 cell line and the positive clones (EMT6/HER2) were screened with blasticidin. Finally, the expression of HER2 in EMT6/HER2 was detected by RTPCR and immunohistochemistry. RESULTS: The fragment of HER2 was amplified and pcDNA6/v5hisHER2 was prepared successfully. No errors were found both in the sequence and ORF of the acquired fragment. The expected fragment of HER2 (1896 bp) was amplified from EMT6/HER2 by RTPCR and positive signals of HER2 were detected in EMT6/HER2 by immunohistochemistry. CONCLUSION: An eukaryotic plasmid encoding HER2 (pcDNA6/v5hisHER2) has been constructed and a cell line expressing HER2 stably has been prepared successfully.KeywordsHER2 ; eukaryotic expression; transfection人表皮生长因子受体(human epidermal growth factor receptors, HER2)属于表皮细胞生长因子受体(EGFR)家族成员, 是一种具有酪氨酸蛋白激酶活性的单链跨膜糖蛋白, 相对分子质量(Mr)为185 000。HER2作为跨膜蛋白, 由胞外结构域(ECD)、 跨膜结构域和胞内结构域(ICD)三部分组成。ECD主要是由两个配体结合区(RLD) 与两个富含半胱氨酸区构成1。HER2 RLD可与EGFR受体家族的其他成员及配体形成复合物, 参与细胞增殖信号的转导2。HER2 基因主要是在人体的胚胎发育时期表达, 它参与多种组织器官的生长发育, 而在成人正常组织中此基因常以单拷贝存在, 表达水平较低; 研究表明, HER2 基因异常扩增或过表达与多种肿瘤的发生、 发展及预后有密切相关, 其中以乳腺癌最为密切, 已成为乳腺癌复发、 患者生存期判断的一个独立指标3。研究显示, HER2 ECD阳性乳腺癌患者对内分泌治疗及化疗的反应性降低、 预后差、 肿瘤呈进行性生长、 总生存和无疾病生存期短及肿瘤复发率高4。因此, 构建重组HER2表达载体并获得稳定转染乳腺癌细胞株可为深入研究HER2基因过表达与乳腺癌的关系及其基因治疗奠定基础。 由于全长HER2 基因有导致正常细胞转化的潜在风险, 而且, 其胞内区具有激酶活性的结构域与其他激酶有较高的同源性5。因此, 本研究我们选取HER2 的ECD构建真核表达质粒（pcDNA6/v5hisHER2）; 将其转入HER2阴性的小鼠乳腺癌细胞(EMT6)中, 以获得稳定表达HER2 ECD的EMT6细胞株（EMT6/HER2）。1 材料和方法1.1 材料 带有HER2全长基因的重组质粒（pcDNA3.1HER2）由北京医药技术研究所林亚军博士惠赠; EMT6细胞购自第四军医大学实验动物研究中心。PCR试剂购自上海生工公司; 质粒pcDNA6/v5his、 TRIzol 及杀稻瘟菌素(Blasticidin)购自Invitrogen公司; AMV反转录酶购自Promega公司; DL 2 000 DNA marker购自TaKaRa; T4 DNA连接酶、 Hind 和Nhe 内切酶购自Fermentas。质粒小提试剂盒购自TIANGEN; RPMI1640完全培养基购自Gbico公司; 胎牛血清购自杭州四季青; 胰酶购自Amersco; 多聚乙烯酰胺(PEI)购自Sigma公司; HER2检测免疫组化广谱试剂盒购自迈新生物技术公司。1.2 方法1.2.1 HER2 ECD基因的扩增以GenBank中NM_004448的ORIGIN为参考序列设计引物, 引物序列上游: 5ctaaccatggagctggcggccttgt3（起自第237 bp）, 下游: 5ccatcaactgcacccacggg3(第2 133 bp终止), 上下游引物5端分别加入Hind 和Nhe酶切位点。拟扩增的HER2胞外区长度为1 896 bp, 加酶切位点后产物总长度为1 914 bp。以pcDNA3.1HER2为模板进行PCR扩增。反应循环参数: 94 5 min, 94 1 min, 62 1 min, 72 1 min, 30个循环, 72延伸10 min。1.2.2 pcDNA6/v5hisHER2的构建 回收并纯化PCR 产物; 用Nhe I和Hind 分别对PCR产物、 pcDNA6/v5his进行双酶切、 纯化; T4 DNA连接酶16水浴过夜连接; 连接产物转化DH5感受态细菌, 并于含50 mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基37培养过夜; 挑取阳性克隆, 扩大培养, 按质粒小提试剂盒说明书提取重组质粒; 用PCR、 双酶切对重组质粒进行鉴定无误后, 送TaKaRa公司测序。1.2.3 pcDNA6/v5hisHER2转染EMT6细胞分别以pcDNA6/v5hisHER2（实验组）及pcDNA6/v5his（空质粒对照组）用PEI法转染EMT6细胞, 以未转染正常EMT6细胞作为空白组。转染方法参照文献6进行。1.2.4 EMT6细胞中HER2 mRNA的检测用TRIzol RNA提取试剂盒, 分别提取正常EMT6、 对照组和实验组抗性细胞中的总RNA, 溶于DEPC水。用HER2 ECD的上下游引物进行PCR扩增。扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分析。1.2.5 HER2在EMT6中表达产物检测(1)细胞爬片制备: 用胰酶消化抗性克隆细胞, 将无菌洁净的盖玻片放入培养瓶中, 加入适量培养液, 待细胞达90%汇合时, 取出盖玻片; 用100 g/L甲醛固定30 min, 置-20保存。(2)用免疫组化方法检测细胞中HER2基因的表达, 具体参照试剂盒说明书。2 结果2.1 HER2胞外区基因的PCR扩增以pcDNA3.1HER2为模板, 用PCR扩增HER2 ECD基因, 琼脂糖凝胶电泳结果显示, PCR产物为长度为1 896 bp, 与预期PCR产物大小一致（图1）。2.2 pcDNA6/v5hisHER2 的鉴定pcDNA6/v5hisHER2转化DH5宿主菌后获得大量阳性克隆, 分别用菌液PCR、 双酶切及测序对重组克隆进行鉴定。(1)随机挑取8个菌落于ALB液体培养中扩增; 做菌液PCR初步鉴定, 获得预期的结果（图2）。(2)将阳性菌落扩增后行质粒小提, 用Hind 和Nhe进行双酶切, 电泳结果显示, 标本1切出与PCR产物大小一致的片段（3、 5可能为不完全酶切, 图3）。标本1送TaKaRa公司测序, 结果显示pcDNA6/v5hisHER2 中HER2 基因序列无误, 读码框正确。2.3 质粒转染和克隆筛选转染细胞经Blasticidin (终浓度为10 mg/L)持续筛选10 d后可观察到单克隆形成, 再以含维持量的Blasticidin(终浓度为2 mg/L)培养液进行克隆扩增, 得到EMT6/HER2（实验组）和EMT6/pcDNA6/v5his(对照组）两种细胞株。而未经转染的正常EMT6细胞在上述筛选压力下1周内死亡脱落（图4）。2.4 RTPCR 测定HER2 mRNA的表达提取经Blasticidin 筛选出阳性克隆细胞的mRNA, 经RTPCR扩增, 琼脂糖凝胶电泳显示, 产物大小约为1 896 bp, 而未转染的EMT6细胞及转染空质粒的对照组细胞均未见此条带(图5)。2.5 免疫组化方法鉴定HER2的表达用免疫组化法检测转染细胞中HER2的表达。对照组EMT6/pcDNA6/v5his和正常EMT6细胞染色后均呈阴性结果(图6A), EMT6/HER2的细胞膜呈阳性染色(图6B)。3 讨论 HER2基因与人类多种肿瘤的发生、 发展及预后有密切联系, 其中以乳腺癌为最。HER2基因参与抑制细胞凋亡; 促进肿瘤细胞存活; 上调血管内皮生长因子(VEGF)/血管通透性因子(VPF); 促进肿瘤新生血管生成; 增加肿瘤细胞的侵袭力; 破坏机体组织抗侵袭屏障等。HER2的RLD区在表达时组成性地同源二聚体化, 或与EGFR 家族的其他成员相互作用形成异源二聚体而参与酪氨酸蛋白激酶的活化, 在肿瘤细胞的信号传导过程中发挥重要的生物学作用7。研究还表明, 在某些肿瘤患者体内确实存在针对HER2原癌蛋白的特异性免疫应答。在某些乳腺癌患者血清中已检测到抗HER2抗体, 并且抗体的水平与HER2的过表达呈正相关8。在抗肿瘤的免疫应答中, 细胞免疫发挥重要的作用。肿瘤特异性杀伤细胞(CTL) 为抗肿瘤免疫应答中的主要效应细胞, 它能识别被MHC分子提呈的抗原。MHC分子中HLAA2.1 在人群中有较高的分布频率, 因此可被HLAA2.1 提呈的肿瘤分子的抗原表位成为肿瘤免疫研究的热点。已有的实验证实, 在HER2的 RLD, 存在可被HLAA2.1 提呈并能诱导出特异性CTL反应的表位肽9。因此, HER2是肿瘤免疫基因治疗研究的一个重要靶分子10。HER2 ECD真核表达质粒的构建可使利用该基因对HER2阳性肿瘤进行主动免疫治疗成为可能。 本研究我们从含有HER2全长基因的质粒pcDNA3.1HER2中克隆了HER2 ECD基因片段, 将其克隆到pcDNA6/v5his真核表达载体中, 成功构建了pcDNA6/v5hisHER2; 并将其导入小鼠EMT6细胞中, 经Blasticidin筛选及免疫组化等方法鉴定, 获得了EMT6/HER2细胞株。我们构建的HER2阳性质粒可用于致敏APC (如DC或巨噬细胞), 并进一步在体内、 外活化HER2特异性CTL, 诱发机体对HER2阳性肿瘤细胞的免疫杀伤, 是目前肿瘤生物治疗研究领域重要课题之一。pcDNA6/v5hisHER2及EMT6/HER2细胞株可作为肿瘤疫苗, 与目前所用的HER2单克隆抗体相比, 因前者为主动免疫, 其杀伤能力强, 作用持续时间长; 同时, 由于免疫记忆的形成, 还可以执行免疫监视功能, 减少相应肿瘤复发的几率; 而且, 由于其为主动免疫应答, 减少了毒性反应的发生11, 12。另外, EMT6/HER2可直接接种小鼠, 建立小鼠HER2阳性乳腺癌模型, 用于对HER2高表达的乳腺癌细胞的生物学特征研究、 治疗药物筛选及寻找新的预防和治疗方法提供技术平台。【参考文献】 1Lohrisch C, Piccart M. 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