静脉移植骨髓间充质干细胞促进脊髓损伤后GDNF基因的表达.doc

静脉移植骨髓间充质干细胞促进脊髓损伤后GDNF基因的表达【摘要】 目的探讨经静脉移植骨髓间充质干细胞(MSCs)对大鼠脊髓损伤(SCI)后胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)表达的影响。方法MSCs提取自成年Wistar大鼠的股骨干骨髓，经原代培养、鉴定及5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)核标记。以改良Allens打击装置制作大鼠T10节段脊髓损伤(SCl)模型，于伤后立即缝合切口并经尾静脉注射移植MSCs。实验共分为3组：MSCs尾静脉移植组(A组)、生理盐水注射组(B组)、正常对照组(C组)。术后不同时间点应用免疫组化法和逆转录聚合酶链反应法(RTPCR)观察MSCs移植后的存活状态以及不同时间点GDNF基因的表达变化。结果免疫组化结果：MSCs经尾静脉移植后在损伤脊髓平面可以检测到迁移及存活，标记细胞呈棕黄色的核标记，以损伤区域为多并向周围迁移，移植术后第14 d，A组Brdu阳性细胞较多，最远于距离损伤区2.5 cm处可检测到。B及C组则均未检测到阳性细胞。RTPCR结果：移植术后第1、3、5 d，A组表达量呈逐渐升高趋势，B组呈一过性表达升高，C组无变化。各时间点A组GDNF mRNA的表达量明显高于B组，P<0.05。免疫组化结果：移植术后第7、14、28 d GDNF的表达量明显高于B组，P<0.05。结论骨髓间充质干细胞经尾静脉移植后可迁移至脊髓损伤区域，并上调胶质细胞源性神经营养因子基因的表达，是该移植方式修复大鼠脊髓损伤的机制之一。 【关键词】 脊髓损伤 骨髓间充质干细胞 胶质细胞源性神经营养因子Effects of mesenchymal stem cells intravenous transplantation on the glial cell line derived neurotrophic factor after the spinal cord injury of rats Abstract：ObjectiveTo observe the effects of mesenchymal stem cells (MSCs)injection from tailvein on the expression of glial cell line derived neurotrophic factor (GDNF) after the spinal cord injury (SCI) of rats.MethodMSCs were cultured from the thighbone of adult wistar rats.The T10 level spinal cord injury was execute by the modifyAllens device. The MSCs labeled by bromodeoxyuridine were transplanted into the vein of tail by injection immediately after spinal cord injury. Adult Wistar rats were randomly divided into three groups: SCI cured with MSCs transplantation (group A), SCI received normal saline(group B),and control group (group C). Then MSCs were detected and the expressions of GDNF of the lesion and neighbor areas were examined by Reversetranscription polymerase chain reaction (RTPCR) and immunohistochemistry.ResultImmunohistochemistry: MSCs labeled by bromodeoxyuridine could be detected in the injuried spinal cordafter transplantation. It was located at the nucleolus of MSCs. The cells survived and migrated rostrallyand caudally from the injection sites. With the time passed, the number of MSCs labeled withbromodeoxyuridine was decreased. RT-PCR: The expression of Group A was increased on the followedday, and the expression of Group B was increased on the 1st day but decrease from the 5th day then pared with group B, transplantation of MSCs significantly enhanced the expression of GDNF mRNA than groupA on the 1st, 3rd, 5th day after cell transplantation(P<0.05), and also significantly enhanced the expression of GDNF on the 7th,14th, 28th day similarly(P<0.05). Conclusion Mesenchymal stem cells can migrate to the spinal cord injuried site and upregulate the expressions of glial cell line derived neurotrophic factor by the methods ofinjection transplantation. It is one of the mechanism of repairing the spinal cord injury by Mesenchymalstem cells transplantation Key words：spinal cord injury; mesenchymal stem cells; glial cell line derived neurotrophic factor 目前，脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)的临床治疗主要是控制继发性损伤，解除脊髓的压迫症状并重建脊柱的稳定性。如何桥接脊髓断端并重建神经传导通路目前仍处于研究阶段。近来的研究发现，干细胞移植有望成为解决该问题的途径之一1。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)来源于自体，具有增殖能力强、多向分化、排斥反应低等优点而受到关注2。本研究通过静脉移植MSCs，探讨治疗SCI的新途径及可行性。1 材料和方法1.1 动物与试剂 Wistar雄性大鼠63只，DMEM培养基、bFGF(碱性成纤维生长因子)，EGF(表皮生长因子)，叔丁基对羟基茴香醚(BHA)、二甲亚砜(DMSO)、胎牛血清，5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)检测试剂盒、GDNF一抗，组化检测试剂盒，mRNA提取试剂盒(Trizol试剂盒)、PCR反应试剂盒(大连宝生生物公司)。1.2 MSCs的培养及大鼠SCI模型的建立 MSCs的培养方法及鉴定参照既往研究3，待MSCs大约长至50汇合时，加入Brdu标记培养基，于37、5CO2培养箱中培育30 min后，调整细胞密度为(1104l)。参照文献4制作大鼠T10节段SCI模型，以鼠尾痉挛性摆动、双下肢软瘫为统一的损伤标准，蛋白胶封闭椎管缺损，逐层缝合。伤后立即经尾静脉移植MSCs，A组以 ml注射器缓慢注入MSCs约0.5 ml，B组注入等量生理盐水，C组未损伤脊髓。1.3 GDNF mRNA的检测 移植术后1、3、5 d快速取材，A组与B组(4只时点)，C组(2只时点)。首先抽提总mRNA，以逆转录(RT法)先合成cDNA，再进行PCR扩增。GDNF引物序列：F5TTTTATTCAAGCCACATCA3，R5AGCCCAAACCCAAGTCAG3；预扩增产物长为203 bp。以actin作内对照，引物序列为：F5GATTGCCTCAGGACATTTCTG-3，R5-GATTGCTCAGGACATTTCTG-3；扩增产物长为690 bp；产物经电泳后用图像分析仪扫描，经凝胶图像系统行光密度分析，目的基因与内对照积分光密度值(IDV)的比值为相对表达量。1.4 Brdu标记细胞及GDNF的组化检测 移植术后第7、14、28 d灌流固定取材，A组与B组(4只时点)，C组(2只时点)，包埋、脱腊、酒精水化、PBS漂洗、胰酶滴片、BSA封闭，加入一抗Brdu小鼠抗大鼠单克隆抗体，二抗孵育30 min，PBS阻断内源性过氧化物酶、DAB显色，苏木素复染，酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，镜下观察。同时间点应用常规SABC法检测GDNF的表达，以PBS替代一抗作为阴性对照，片厚40 m，DAB显色。所有图像经平均灰度值的分析，予半定量检测。1.5 统计学分析 所有指标以(s)表示，SPSS 10.0统计软件作方差分析。2 结果2.1 Brdu阳性细胞的检测 A组，Brdu阳性细胞在移植后第7 d可检测到，为棕黄色的核标记，近损伤区阳性细胞较多(图1)，移植术后第14 d，A组Brdu阳性细胞继续增多，最远于距离损伤区2.5 cm处仍可检测到。B及C组均未见阳性细胞。A组与B组之间差异有显著的统计学意义(A组的Brdu阳性细胞为1085.6mm2，B组与C组无阳性细胞，P<0.01)，移植术后第28 d，标记MSCs逐渐减少。图1 移植后Brdu标记的细胞(1040)（略）2.2 GDNF mRNA的表达变化(图2) GDNF mRNA在正常大鼠脊髓(C组)内存在表达。MSCs移植术后第1 d，A组与B组均有GDNF mRNA的表达，A组平均IDV比值为0.85，B组为0.43，A组表达量较B组平均增加了32(P<0.05)。移植术后第3 d，A组与B组GDNF mRNA表达量均有升高，A组表达量较B组平均增加25.3(P<0.05)。移植术后第7 d，B组表达量略有下降，而A组仍在上升。图2 GDNF mRNA表达的动态变化（略）2.3 GDNF免疫组化反应(图3) GDNF在正常成年大鼠脊髓(C组)表达弱，阳性颗粒定位于神经元和胶质细胞的胞浆。MSCs移植术后第7 d，A组与B组GDNF表达均有所增强，A组平均表达量要高于B组(P<0.05)。第14 d，A组表达至高峰，B组表达也有所增强，A组与B组比较差别有统计学意义(P<0.05)。第28 d，DMEM组表达略增强，MSCs仍然持续高表达，组间差别有统计学意义。 图3 GDNF的形态学表达（1040）（略）3 讨论 中枢神经系统生理活动的正常进行是与周围微环境的稳定密不可分的。在结构上表现为血液和脑脊液中的物质在进入脑组织时要受到一定的限制，即为脑屏障。脑屏障由血脑屏障(bloodbrain barrier，BBB)、血脑脊液屏障(bloodCSFbarrier)以及脑脊液脑屏障(CSFbrain barrier)组成，其中BBB发挥主要的生理功能。Akiyama等5将同样数量的MSCs、雪旺氏细胞、嗅球鞘细胞分别经尾静脉注入髓鞘损伤的大鼠，发现只有MSCs可通过血脑屏障。Lu等6分别通过静脉和动脉将MSCs注入脑创伤的大鼠动物模型，发现MSCs可迁移至脑内，尤其是创伤部位，从而提示MSCs对中枢神经系统损伤有一定的趋化性。静脉注射MSCs通过BBB的机制可能包括：(1)脊髓损伤各种炎性因子和血管活性物质释放7，使BBB的通透性增加；(2)BBB固有薄弱环节(如脑室周围、脉络丛等)参与MSCs的迁移；(3)脊髓损伤部位具有一定的趋化作用。在本研究中于移植术后2周内Brdu阳性细胞在损伤区域不断增多也提示损伤部位具有一定的趋化作用。 Harvey等8研究认为MSCs移植可支持SCI后血管神经再生和神经网络的重建。在骨折或者心肌梗塞的损伤修复过程中，骨髓中的MSCs会进入循环系统，最后到达损伤部位修补损伤。具体机制是在发生上述损伤时受到炎症因子和趋化因子刺激，MSCs表面的黏附分子表达降低，MSCs进入血液循环，到达损伤部位后，同时损伤区域黏附分子表达升高，MSCs在迁移后到损伤区后局部增殖分化，修补缺损9。虽然本研究中MSCs的分化转归未能跟踪检测，但可以推测对脊髓损伤的重建是有着积极作用的。GDNF基因是TGF家族中的一个亚族，作为靶源性神经营养因子，GDNF通过逆行转运或旁分泌作用对特异神经元起到营养作用。在神经细胞分化过程中，GDNF通过RasMARK通路刺激神经元的存活和突起的生长，通过P13K信息系统诱发神经元片状伪足的形成，后者直接参与神经轴突的发生和多巴胺能神经元的分化。SCI后残留神经元及胶质细胞均可分泌GDNF，后者通过靶源性、自分泌和旁分泌方式与相应的受体GDNFR及Ret结合，激发多种信号通路促进中枢神经的分化生长与存活。 目前MSCs移植治疗多通过局部直接注射移植，移植的MSCs数目不确定且存活率低。本研究证实MSCs可通过BBB，并可明显增加GDNF基因的表达，因此经静脉移植MSCs是探索SCI治疗的途径之一。【参考文献】 1 Schwab MERepairing the injured spinal cordScience，2002，8：1029-10312 Carcia R，Aguiar J，Alberti E，et alBone marrow stromal cells produce nerve growth factors and glial cell line derived neurotrophic factorJBiochemical Biophysical Research Communications,2004，316(3)：753-7543 李国良，祝勇，赤仁杰，等骨髓间充质干细胞移植对大鼠脊髓损伤后BDNF表达的形态学研究J