生物(新人教版选修3)重点整理.ppt

专题1 基因工程,简述基因工程的原理 说出DNA重组技术的基本工具及其作用、特点,基因工程的原理及操作工具,阅读：人教版P4-6 或 苏教版P9-13,一、基因工程的概念,基 因 工 程 的 操 作 工 具,限制酶,限制酶,限制酶,DNA连接酶,DNA连接酶,运载体,（一）限制性核酸内切酶“分子手术刀”,1、来源,2、功能,寻根问底,根据你掌握的知识，你能推测这类酶存在于原核生物中的作用是什么吗？,二、DNA重组技术的基本工具,（限制酶）,主要是从原核生物中分离纯化而来,一种限制性核酸内切酶只能识别一种 特定的核苷酸序列，并在特定的切点上 切割DNA分子。 （特异性）,原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是生物在长期的进化过程中形成了完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制性核酸内切酶就是细菌的防御性工具，当外源DNA侵入时，限制性核酸内切酶会将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制性核酸内切酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而保护自身的作用。,-G A A T T C-,-C T T A A G-,C C C G G G,G G G C C C,黏性末端,平末端,C C C G G G,G G G C C C,限制性核酸内切酶能识别特定的核苷酸序列：,-G A A T T C-,-C T T A A G-,黏性末端,尝试写出下列序列受EcoRI限制酶作用后的黏性末端,例1、下列关于限制酶的说法错误的是 A、限制酶广泛存在于各种生物中，但微生物中很少 B、限制酶被用来切割DNA分子，获取目的基因 C、一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序 列 D、限制酶能在特定部位两个核苷酸之间切断磷酸二酯键,A,变式训练1：限制酶是一种核酸切割酶，可辨识并切割DNA 分子上特定的核苷酸碱基序列。下图为四种限 制酶 BamHI , EcoRI , Hind 以及 BgI的辨 识序列： 其中哪两种限制酶所切割出来的DNA片段末端，可 以互补结合？其正确的末端互补序列为何？ ABamHI和EcoRI；末端互补序列AATT BBamHI和Hind ；末端互补序列GATC CBamHI和BgI；末端互补序列GATC DEcoRI和Hind ；末端互补序列AATT,C,（二）DNA连接酶“分子缝合针”,1、作用把两条DNA末端之间的缝隙“缝 合”起来。,2、分类,E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，不能将双链DNA平末端之间进行连接,T4 DNA连接酶既可将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来，也能将双链DNA平末端之间进行连接，但连接平末端的效率比较低,寻根问底：,DNA连接酶和DNA聚合酶是一回事吗？为什么？,不是。两者的差别在于 （1）DNA聚合酶只能将单个的核苷酸加到已有的核苷酸片段上，形成磷酸二酯键，而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键。 （2）DNA聚合酶是以一条DNA为模板，将单个核苷酸通过形成磷酸二酯键形成一条与摸板互补的DNA链；而DNA连接酶是将双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要摸板。 （3） DNA聚合酶形成的是单链DNA，DNA连接酶形成的是双链DNA。,区别几种不同的酶,限制酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶 DNA解旋酶 DNA水解酶（DNA酶）,三、基因进入受体细胞的载体 “分子运输车”,1、通常以质粒作为载体 质粒细菌细胞中一种很小的环状DNA分子。 裸露的、结构简单、独立于细菌拟核之外，并且有自我复制能力,思考,具备什么样的条件才能充当“分子运输车”？,1能在受体细胞中稳定的保存并大量复制 2有一个或多个切割位点 3有标记基因（一般是抗生素的抗性基因）,三、基因进入受体细胞的载体 “分子运输车”,2、作用 将目的基因转移到受体细胞，并利用它在 受体细胞中对目的基因进行大量复制,3、其他载体 噬菌体、动植物病毒,在基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。,三、基因进入受体细胞的载体 “分子运输车”,一、基因工程的概念,二、基因工程操作工具及各自作用、特点 1. 限制酶切割目的基因的运载体 特异性 （切断磷酸二酯键） 2. DNA连接酶-连接目的基因和运载体 （连接磷酸二酯键） 3. 运载体-将目的基因转移到受体细胞 （具备的条件？） 4. 区别几种不同酶的作用,1、从基因文库中获取,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。,一、目的基因的获取,基因组文库,含有一种生物全部基因的基因文库,部分基因文库,含有一种生物部分基因的基因文库,像国家图书馆,像市图书馆 如cDNA文库,基因文库像“图书馆” 每个基因是一本书, 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、_、_(做启动子)、 _.前提条件：,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为循环的次数）,结果：,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,2、利用PCR技术扩增目的基因,一、目的基因的获取,过程：,a、DNA变性（95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性25）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（72）：在Taq酶的作用下，从引物 的 5端3端延伸，合成与模板互补 的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,引物,模板DNA,热稳定DNA 聚合酶（Taq酶）,DNA解链,引物结合到 互补DNA链,Taq酶从引 物起始进行互补链合成,加热至7075,加热 至9095,冷却 至 5560,若基因较小，核苷酸序列已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。,3、人工合成,一、目的基因的获取,1.用一定的_切割 质粒，使其出现一个切 口，露出_。 2.用_切断目 的基因，使其产生_ _。,二、制备重组DNA分子, 核心,3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处， 再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制性核酸内切酶,黏性末端,限制性核酸内切酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,质粒,DNA分子,限制酶处理,一个切口 两个黏性末端,两个切口 获得目的基因,DNA连接酶,重组DNA分子（重组质粒）,4.过程:,二、制备重组DNA分子,复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因,它们有什么作用？,二、制备重组DNA分子,三、转化受体细胞,转化 ,方法,将目的基因导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将目的基因导入 微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,用钙离子处理细胞（感受态细胞）,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞,（1）农杆菌转化法,双子叶植物中常用方法,（2）基因枪法,（3）花粉管通道法,单子叶植物常用的转化方法，成本较高,我国独创的转化方法,如：我国的转基因抗虫棉,三、转化受体细胞,书P16,显微注射技术,注入的是含有目的基因的表达载体,是转基因动物中采用最多、最有效的一种将目的基因导入动物细胞的方法。,2、将目的基因导入动物细胞,三、转化受体细胞,用原核细胞作为受体细胞的原因？,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少等,大肠杆菌应用最为广泛,大肠杆菌细胞最常用的转化方法： Ca2+处理细胞感受态细胞重组表达载体DNA溶于缓冲液中与感受态细胞混合在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子完成转化过程。,3、将目的基因导入微生物细胞,三、转化受体细胞,检查是否成功,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交（注意与上不同之处）,抗原抗体杂交,四、筛选出获得目的基因的受体细胞,DNA分子杂交示意图,采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。,四、筛选出获得目的基因的受体细胞,第二节 基因工程的应用,一、基因工程的应用,二、转基因生物的安全性问题,三、生物武器的危害性,1、抗虫转基因植物,从某些生物中分离出具有杀虫活性的基因，将其导入作物中，使其具有抗虫性。,例如，我国转基因抗虫棉就是转入Bt毒蛋白基因培育出来的，它对棉铃虫具有较强的抗性。,一、转基因植物,2、抗病转基因植物,3、其它抗逆转基因植物,4、利用转基因改良植物的品质,用基因重组蓝玫瑰,1、用于提高动物生长速度,二、转基因动物,超级小鼠,转生长激素基因鲤鱼,2、用于改善畜产品的品质,3、用转基因动物生产药物,4、用转基因动物作器官移植的供体,假如某位心脏病人换上了经过改造的猪的心脏，在生活中他会遭到歧视吗？,基因治疗使把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。,三、基因工程药物异军突起,四、基因治疗曙光初照,生产干扰素的车间,用于基因治疗的基因种类 第一类 从健康人体上分离得到的功 能正常的基因； 第二类 反义基因 第三类 编码可以杀死癌变细胞的蛋 白酶基因，又称自杀基因,4 蛋白质工程的应用,一、蛋白质工程崛起的缘由,通过基因工程能够大规模生产生物体内微量存在的活性物质，并借助转基因而改变动植物性状，得以在人类医疗保健中进行基因诊断和基因治疗。然而在广泛利用自然界各种蛋白质的过程中就发现，这些蛋白质只是适应生物自身的需要，而对它们进行产业化开发往往不合意，需要加以改造。1983年Ulmer首先提出蛋白质工程，它是指按照特定的需要，对蛋白质进行分子设计和改造的工程。自此以后，蛋白质工程迅速发展，已成为生物工程的重要组成部分。,4 蛋白质工程的应用,在已研究过的几千种酶中，只有极少数可以应用于工业生产，绝大多数酶都不能应用于工业生产，这些酶虽然在自然状态下有活性，但在工业生产中没有活性或活性很低。这是因为工业生产中每一步的反应体系中常常会有酸、碱或有机溶剂存在，反应温度较高，在这种条件下，大多数酶会很快变性失活。提高蛋白质的稳定性是工业生产中一个非常重要的课题。一般来说，提高蛋白质的稳定性包括：延长酶的半衰期，提高酶的热稳定性，延长药用蛋白的保存期，抵御由于重要氨基酸氧化引起的活性丧失等。,例如:干扰素是一种抗病毒、抗肿瘤的药物。将人的干扰素的cDNA在大肠杆菌中进行表达，产生的干扰素的抗病毒活性为106 U/mg，只相当于天然产品的十分之一，虽然在大肠杆菌中合成的-干扰素量很多，但多数是以无活性的二聚体形式存在。为什么会这样？如何改变这种状况？研究发现，-干扰素蛋白质中有3个半胱氨酸（第17位、31位和141位），推测可能是有一个或几个半胱氨酸形成了不正确的二硫键。研究人员将第17位的半胱氨酸，通过基因定点突变改变成丝氨酸，结果使大肠杆菌中生产的-干扰素的抗病性活性提高到108 U/mg，并且比天然-干扰素的贮存稳定性高很多。,“后基因组时代”将是“蛋白质组学时代”，即从对基因信息的研究转向对蛋白质信息的研究，包括研究蛋白质结构、功能与应用及蛋白质相互关系和作用。 蛋白质工程就是在对蛋白质的化学、晶体学、动力学等结构与功能认识的基础上，对蛋白质人工改造与合成，最终获得商业化的产品。,二、蛋白质工程的基本原理,蛋白质工程的主要步骤通常包括： （1）从生物体中分离纯化目的蛋白； （2）测定其氨基酸序列； （3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;,（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响； （5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变； （6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。,（一）蛋白质的分子设计与改造 蛋白质工程首先是以蛋白质的结构为基础，通过蛋白质的一级结构、晶体结构和溶液构象的研究，积累了成千上万蛋白质一级结构和高级结构的数据资料，并编制成系统的数据库，得以从中找出蛋白质分子间的进化关系、一级结构和高级结构的关系、结构与功能的关系方面的规律。,蛋白质作为生物大分子是生物化学和分子生物学的研究重点，大量蛋白质被分离纯化，测定了它们的结构、性质和生物学作用。分子生物学有关基因组的研究，也可以用以推测出一些未知蛋白质的结构与功能。采用定位诱变的方法，可以对编码蛋白质的基因进行核苷酸密码子的插入、删除、置换和改组，其结果为分子改造提供新的设计方案。现有的蛋白质是生物长期进化的结果，蛋白质工程则是对生物进化的模拟，按照蛋白质形成的规律，改造蛋白质或构建新的蛋白质。 蛋白质的改造通常需要先经周密的分子设计，然后依赖基因工程获得突变型蛋白质，以检验其是否达到了预期的效果。如果改造的结果不理想，还需要从新设计再进行改造，往往经历多次实践摸索才能达到改进蛋白质性能的预定目标。,（二）蛋白质改造工程举例 1水蛭素改造 水蛭素是水蛭唾液腺分泌的凝血酶特异抑制剂，它有多种变异体，由65或66个氨基酸残基组成。水蛭素在临床上可作为抗栓药物用于治疗血栓疾病。为提高水蛭素活性，在综合各变异体结构特点的基础上提出改造水蛭素主要变异体HV2的设计方案，将47位的Asn（天冬酰胺）变成Lys（赖氨酸），使其与分子内第4或第5位Thr（苏氨酸）间形成氢键来帮助水蛭素N端肽段的正确取向，从而提高凝血效率，试管试验活性提高4倍，在动物模型上检验抗血栓形成的效果，提高20倍。,2生长激素改造 生长激素通过对它特异受体的作用促进细胞和机体的生长发育，然而它不仅可以结合生长激素受体，还可以结合许多种不同类型细胞的催乳激素受体，引发其他生理过程。在治疗过程中为减少副作用，需使人的重组生长激素只与生长激素受体结合，尽可能减少与其他激素受体的结合。经研究发现，二者受体结合区有一部分重叠，但并不完全相同，有可能通过改造加以区别。由于人的生长激素和催乳激素受体结合需要锌离子参与作用，而它与生长激素受体结合则无需锌离子参与，于是考虑取代充当锌离子配基的氨基酸侧链，如第18和第21位His（组氨酸）和第17位Glu（谷氨酸）。实验结果与预先设想一致，但要开发作为临床用药还有大量的工作要做。,3胰岛素改造 天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了其降血糖作用，也增加了抗原性，这是胰岛素B23-B28氨基酸残基结构所致。利用蛋白质工程技术改变这些残基，则可降低其聚合作用，使胰岛素快速起作用。该速效胰岛素已通过临床实验。,4治癌酶的改造 癌症的基因治疗分二个方面：药物作用于癌细胞，特异性地抑制或杀死癌细胞；药物保护正常细胞免受化学药物的侵害，可以提高化学治疗的剂量。疱疹病毒（HSV）胸腺嘧啶激酶（TK）可以催化胸腺嘧啶和其它结构类似物磷酸化而使这些碱基3-OH缺乏,从而阻断DNA的合成，杀死癌细胞。HSVTK催化能力可以通过基因突变来提高。从大量的随机突变中进行筛选出一种酶,在酶活性部位附近有6个氨基酸被替换，催化能力20倍以上。 蛋白质工程的发展很快，研究工作很多，以上仅介绍了几个例子。蛋白质工程除了用于改造天然蛋白质或设计制造新的蛋白质外，其本身还是研究蛋白质结构功能的一种强有力的工具，它在解决生物理论方面所起的作用，可以和任何重大的生物研究方法相提并论。,何谓蛋白质工程？,在现代生物技术中，蛋白质工程出现得最晚，是在20世纪80年代初期出现的。1983年 “蛋白质工程”这个名词出现后，随即被广泛接受和采用。蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础,通过基因修饰或基因合成,对现有蛋白质进行改造,或制造一种新的蛋白质,以满足人类的生产和生活的需求。,三、蛋白质工程的进展和前景,蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学科的一些前沿领域的最新成就，它把核酸与蛋白质结合、蛋白质空间结构与生物功能结合起来研究。蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代，为蛋白质和酶在工业、农业和医药方面的应用开拓了诱人的前景。蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时期。,1、基因工程,2、蛋白质工程,（1）基本工具 （2）基本操作程序 （3）应用,专题1 基因工程,A,A,D,习题训练,B,B,D,D,D,C,A,B,7、碱基数、氨基酸数计算,碱基个数,n,碱基个数,氨基酸个数,例：由n个碱基组成的基因，控制合成一条多肽链组成的蛋白质，氨基酸的平均相对分子质量为a，则该蛋白质的现代分子质量最大为 A.a/6 B.a/3-18(n/3-1) C.na-18(n-1) D.na/6-18(n/6-1),D,1、在遗传信息的转录和翻译过程中，翻译者是 A. 基因 B. 信使RNA C. 转移RNA D. 遗传密码,3、下列关于遗传密码的叙述中，错误的是 A. 一种氨基酸可能有多种与之对应的遗传 密码 B. GTA肯定不是遗传密码 C. 每种密码都有与之对应的氨基酸 D. 信使RNA上的GCA在人细