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基因工程复习笔记第一章 基因工程概述1. 基因工程的概念：是指在基因水平上的遗传工程,它是用人为方法将大分子(DNA)提取出来,在离体条件下用适当的工具酶进行切割后,把它与作为载体的DNA分子连接起来,然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中,以让外源遗传物质在其中“安家落户”,进行正常的复制和表达,从而获得新物种的一种崭新的育种技术。2. 1972年，美国斯坦福大学的Paul Berg及其同事第一个创造重组DNA分子。3. 1973年，Cohen & Boyer首次完成重组质粒DNA对大肠杆菌的转化，标志着基因工程的诞生。4. 1981年，第一个转基因哺乳动物小鼠在美国问世；1982年，基因工程胰岛素商品在美国投向市场，同年转基因烟草获得成功并能按孟德尔方式遗传给后代。5. 基因工程的通用策略：6. 基因克隆是如何使含有单个基因的DNA片段得到纯化的？ 大分子质量的DNA会含有许多特殊限制性内切酶位点，因此用一种限制酶处理一完整染色体或整个基因组会产生许多不同的DNA片段，每一个片段带有基因组的一个不同的基因或一个不同的小片段。当全部片段与用同种限制酶处理过的载体分子混合时，每个片段将插入一个不同的载体分子。同样，当用这些质粒转化宿主细胞时，每个宿主细胞将只接收一个质粒DNA分子，而筛选出的含重组质粒的每个菌落实际上会含有某一特异的供体DNA片段的多个拷贝。一旦带有待研究的特定基因的克隆被确认，此重组DNA分子可从宿主细胞中提取出来纯化。 第二章 分子克隆工具酶1. 限制性核酸内切酶的概念：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。2. 限制性核酸内切酶的分类依据：依据酶的亚单位组成、识别序列的种类以及是否需要辅助因子可分为：型酶(1%)、型（s型(5%)）酶(93%)和型酶(1%)。 3. 限制性核酸内切酶的命名：以提取这类酶的生物的属名第一个字母，种名的前两个字母以及菌株代号来命名。如：从Haemophilus influenze Rd中提取到的第三种限制型核酸内切酶被命名为Hind 4. 粘性末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置是交错的，对称地分布在识别序列中心位置两侧，这样形成的DNA片段末端称为。5. 平末端：两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置处在识别序列的对称结构中心，这样切割的结果产生的DNA片段末端是平齐的，称之为。6. 同裂酶：一些来源不同的限制性核酸内切酶具有相同的识别序列，这样的酶称。如： BamHI和BstI均可识别GGATCC。包括同序同切酶（同工酶）和同序异切酶。7. 同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不同，但是切割DNA分子产生相同的DNA末端。如：TaqI：T/CGA；ClaI：AT/CGAT；AccI：GT/CGAC8. 星星活性：某些限制性核酸内切酶在特定条件下，可以在不是原来的识别序列处切割DNA，这种现象称为Star活性。Star活性产生原因：反应系统中甘油含量过高，酶过量，反应时间过长，pH和盐浓度不适等。9. DNA物理图谱：当一种DNA分子的核苷酸序列被全部测定后，此DNA分子上所有的限制性核酸内切酶的识别序列则全部知道，可以绘制出DNA分子上每种限制性核酸内切酶的识别序列分布图，这样的图称为限制性图谱或物理图谱。10. 酶切反应系统：底物DNA，限制性核酸内切酶的用量（取决于酶本身催化活性和底物样品），限制性核酸内切酶反应缓冲液（应含有氯化镁或醋酸镁、氯化钠或醋酸钾、二硫苏糖醇（DTT）或-巯基乙醇、Tris-HCl或Tris-Ac），限制性核酸内切酶反应温度（多数为为37 ）。11常见酶切操作步骤：在一Eppendorf管中依次加入13l ddH2O、2 l 10倍缓冲液、4l 底物DNA和1l 限制性核酸内切酶液，共20l；摇匀，离心20 sec；在最适温度下保温13hr；升温至65，1015min，使酶失活。12. 大肠杆菌中甲基化酶的种类：Dam甲基化酶：可在序列GATC中A的N6位置引入甲基。Dcm甲基化酶：能特异性识别DNA双链上的CCA(T)GG序列，并使第二个胞嘧啶C的C5甲基化EcoKI甲基化酶：识别AAC（N）6GTGC和TTG（N）6CACG序列中中A的N6位置。13. 依赖于甲基化的限制系统： McrA： mcrA基因表达E.coli防御体系中起重要作用的McrA酶，该酶能特异性地作用于外来DNA上的被甲基化的胞嘧啶序列，即C5mCGG特异序列，使之分解，对大肠杆菌本身起保护作用。mcrA基因的变异，导致上述功能缺失，对外来DNA中被甲基化的胞嘧啶特异序列（C5mCGG）失去作用，有利于限制酶及甲基化酶的克隆体的稳定。 McrB, C： mcrB, C基因表达McrB和McrC两种特异性蛋白，它们在E.coli的防御系统中起重要作用。一般情况下，只有这两种蛋白同时存在时才表现出活性，McrC具有识别和调节功能，它能特异性的结合到外源DNA被甲基化的胞嘧啶的特异序列G5mC上，然后由McrB蛋白切断（McrB蛋白是特异性切断外来DNA中G5mC序列的限制性核酸内切酶)，防御外来DNA的侵入。mcrB, C基因的变异，使上述的对外来DNA的防御作用缺失，对质粒的转化有利。 Mrr： mrr基因是大肠杆菌细胞防御系统中重要的基因之一，它能严格限制被甲基化的外源DNA的介入。另外，它对限制酶Acc I，CviR I，Hinf I (Hha II)，Nla II，Pst I以及N6-腺嘌呤甲基化酶和C5-胞嘧啶甲基化酶活性有明显的抑制作用。mrr欠损株（基因型）可用于含有N6-mA和C5-mC的DNA的转化。另外，含有此基因型的菌株也可用于限制酶和甲基化酶的克隆体.14DNA聚合酶：以单链DNA为复制模板，由5端开始复制到3端的酶。原核生物大肠杆菌DNA聚合酶 种类：15.几种常用DNA聚合酶： 大肠杆菌 DNA 聚合酶I：5-3DNA聚合酶活性，5-3外切核酸酶活性，3-5外切酶活性。Klenow DNA聚合酶：是大肠杆菌 DNA 聚合酶I经蛋白酶裂解而从全酶中去除具5-3外切核酸酶活性后的大片段肽段，其聚合活性和3-5外切酶活性不受影响。T4噬菌体DNA聚合酶：来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，与Klenow酶相似（没有5-3外切酶活性，其它同大肠杆菌DNA聚合酶I），但3-5外切活性强200倍。 反转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶,有5-3合成DNA活性,无3-5外切核酸酶活性。16. RNA聚合酶: 识别DNA中启动子特异序列,合成RNA,无需引物。17连接酶：T4 DNA连接酶: T4噬菌体感染大肠杆菌产生，反应底物: 黏端、切口、平末端的RNA(效率低)或DNA；反应条件：ATP,16，约4hr；4，过夜反应。大肠杆菌DNA连接酶：活性与T4连接酶相似，但需烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的参与，与平末端连接效率很低，不连接RNA。Taq DNA连接酶：可连接dsDNA中的缺口间的两个寡核苷酸，需NAD+的参与，最适反应温度45-65。T4 RNA连接酶：可使单链DNA或RNA之间相互连接，可用于标记RNA的3末端，单链DNA或RNA的连接、增强T4 DNA连接酶的连接活性以及合成寡核苷酸。18T4多核苷酸激酶：可将ATP的-磷酸基团转移至DNA或RNA的5末端。主要用于对缺乏5磷酸DNA或合成接头进行磷酸化，同时可对末端进行标记。 19碱性磷酸酶：主要来源于牛小肠碱性磷酸酶（CIP或CIAP）能催化除去DNA或RNA5磷酸的反应，可防止DNA片段自连。第三章 分子克隆载体1. 分子克隆载体必须具备的元件：具备复制起点；具备多克隆微点；有两个或两个以上的选择标记。2. 表达载体必须具备的元件：具备复制起点；具备多克隆微点；有两个或两个以上的选择标记；启动子，终止子和核糖体结合位点。3. 质粒：一种存在于宿主细胞中，独立于染色体外的dsDNA分子，一般以超螺旋共价闭环DNA分子形式存在。4. 质粒的不亲和性：两个质粒在同一个宿主细胞中不能共存的现象。5. 松弛型质粒：拷贝数多（10个拷贝以上）的质粒，小质粒较多。6. 选择标记基因：氨苄青霉素抗性基因（ampr）：Ampicillin可以抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性，即抑制细胞壁肽聚糖的合成。 ampr编码一种可分泌到细菌细胞周间质的酶，催化-内酰胺环的水解，使氨苄青霉素失活。四环素抗性基因（tetr）：四环素可与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位过程。 tetr编码一个由399个氨基酸组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。（光敏感）氯霉素抗性基因（Cmr）：氯霉素可与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质的合成。常用的cat基因编码氯霉素乙酰转移酶，即一个四聚体细胞质蛋白，在乙酰辅酶A存在时，该蛋白催化氯霉素形成氯霉素羟乙酰氧基衍生物，使之不能与核糖体结合。卡那霉素（新霉素）抗性基因：卡那霉素和新霉素是氨基糖苷类抗生素，都可与核糖体结合并抑制蛋白质的合成。该基因（kanr/neor）是一种编码氨基糖苷磷酸转移酶的基因，该酶可使这两种抗生素磷酸化，从而干扰了它们向细胞内的主动转移。7. 卫星菌落：指含氨苄青霉素抗性基因（ampr）的阳性菌落能编码一种酶，该酶分泌到细菌细胞周间质区，催化-内酰胺环的水解，即可将培养基上阳性菌落周围的氨苄青霉素水解掉，解除其毒性。于是，在大的阳性菌落周围便有许多不含ampr的小的菌落生长，即卫星菌落。8. -互补：现在使用的许多载体都带有一个E.coli DNA的短区段，其中含有-半乳糖苷酶的-肽基因（lacZ）的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。这个编码区中插入了一个MCS，它并不破坏读框，但是可使少数几个氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于编码-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞，虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可融为一体，形成具有酶活性的蛋白，从而实现互补，这种现象称为。9.蓝白斑筛选的基本原理：在使用的许多载体都带有一个E.coli DNA的短区段，其中含有-半乳糖苷酶的-肽基因（lacZ）的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。这个编码区中插入了一个MCS，由于片段小，它并不影响基因的功能。这种载体适用于编码-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞，虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可融为一体，形成具有酶活性的蛋白，从而实现互补，编码有活性的-半乳糖苷酶。但当在MCS插入外源片段后，片段足够大，影响基因的功能，导致lacZ基因无法编码-半乳糖苷酶的氨基端，所以当插入外源片段的重组质粒转入相应宿主细胞时，宿主细胞无法产生有活性的-半乳糖苷酶。在培养皿上加入IPTG和X-gal，-半乳糖苷酶的产生还需IPTG诱导，-半乳糖苷酶分解X-gal后可产生蓝色产物。这样，在平板上导入外源片段的重组细胞为白色菌落为白色菌落，没有导入外源片段的正常细胞则为蓝色菌落，以此筛选出导入外源片段的重组细胞。10.使用最早，人工构建的第一个分子克隆载体是pBR322。11.噬菌体的性质：噬菌体由DNA和外壳蛋白组成。噬菌体分头部和尾部，DNA集中在头部。DNA在噬菌体中是线状，全长48502bp，左右各有12个核苷酸组成的5凸出 粘性末端，且两者互补。进入宿主细胞后，粘性末端连接成为环状DNA分子，这样能连接的末端称为cos位点。12.噬菌体载体可插入的外源DNA分子大小为9-23kb，质粒载体可插入的外源DNA分子大小为7-10kb，人工染色体载体可插入的外源DNA分子大小为1000kb甚至3000kb，粘粒载体可插入外源DNA大小为30-40Kb。13.噬菌体载体的选择标记：lacZ基因；cI基因失活（cI基因能全面抑制并阻断裂解生长必须基因的表达，促进-噬菌体进入溶原状态。外源基因插入cI基因中，使E.coli进入裂解生长状态）； Spi筛选第四章 人工染色体载体1. 人工染色体载体：人工染色体载体实际上是一种“穿梭”载体，含有质粒克隆载体所必备的第一受体（如：E.coli）源质粒复制起始位点（ori），第二受体(如：酵母菌)染色体DNA的着丝点、端粒和复制起始位点的序列以及合适的选择标记基因。2. 人工染色体载体的种类：YAC(酵母人工染色体载体)：以pBR322为骨架建立，带有pBR322的复制起点ori和筛选标记基因Ampr，另外还加入作为酵母chr.所必须的一些成分：一段控制酵母chr.复制的自主复制序列（ARS），一段来自酵母chr.的着丝粒序列，一对酵母的端粒序列，选择标记TRP1和URA3，克隆位点。BAC(细菌人工染色体载体):与常规克隆载体的核心区别在于其复制单元来自F质粒，包括严谨型控制的复制区oriS,启动DNA复制的由ATP驱动的解旋酶RepE,以及3个确保低拷贝并使质粒精确分配至自带细胞的基因座parA,parB,parC.PAC(P1人工染色体载体):由P1噬菌体载体改进而来，包括从pBR322衍生来的colE1复制子，最小的P1包装位点，11Kb的腺病毒填充片段，Tn903来源的卡那霉素抗性基因，P1质粒复制子和分配系统，由Lac启动子驱动的裂解型P1复制子scaB.第五章 表达载体1. 表达载体中启动子的种类：Plac 启动子；Ptac 启动子；T7启动子（T7噬菌体）；PL启动子（噬菌体）。2. T7启动子的工作原理：大肠杆菌BL21(DE3)是常用的pET表达载体的宿主菌，该君主染色体的BL21区整合有一个噬菌体DNA，在噬菌体DE3区有一个T7RNA聚合酶基因（T7基因1），该基因编码T7RNA聚合酶，并受LacUV5启动子控制。当pET载体进入BL21(DE3)细胞后，由于宿主细胞的LacI基因表达产生阻抑物，从而抑制T7RNA聚合酶基因的表达，不能编码T7RNA聚合酶。pET载体上的外源基因受T7启动子，这样，没有T7RNA聚合酶结合到T7启动子上，外源基因便不能表达。当存在IPTG诱导后，使阻抑物失去阻抑作用，T7RNA聚合酶基因得以表达，产生T7RNA聚合酶，从而T7启动子控制的外源基因表达。3. 穿梭载体：能在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。4. 整合载体：在生物学研究和基因工程应用中，会涉及将某个基因或某些基因插入到染色体中去的工作，承担这部分工作的载体。第六章 基因操作中大分子的分离和分析1. 碱裂解法小量抽提质粒的步骤：(1)将细菌沉淀重悬于100l预冷的溶液I 中,剧烈震荡;(2)加200l新鲜配制的溶液II , 缓和震荡,水浴5min;(3)加150l预冷溶液III 缓和震荡,冰浴5min;(4)4 以12000g离心5min,将上清转移到另一离心管中(5)向上清中加入等体积酚：氯仿（1：1），反复混匀，12000rpm离心5min，将上清转至另一离心管中;(6)向上清加入2倍体积无水乙醇，混匀后室温放置510min，12000rpm离心5min，弃上清，吸干离心管中的液体;(7)用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清，自然干燥;(8)加20l TE缓冲液，其中含有20g/ml的胰RNA酶，使DNA完全溶解(9)凝胶电泳检测抽提结果，剩下的DNA放-20C冰箱保存。2.碱裂解法提取质粒DNA原理：在pH介于12.0-12.5这个狭窄范围内，线性DNA 双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互缠绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭环质粒DNA的两条链仍保持在一起，因此复性迅速准确，而线性染色体DNA的两条链彼此已经完全分开，复性就不会那么迅速准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。3. 碱裂解法提取质粒DNA中各溶液的作用：溶液I (50mmol/L葡萄糖,25mmol/L Tris-HCl pH8.0,10mmol/L EDTA)作用：悬浮细胞溶液II (0.2mol/L NaOH, 1%SDS)作用：形成碱性环境，裂解细胞并使DNA,蛋白质和RNA变性溶液III (50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml)作用：中和溶液II形成的碱性环境，使质粒DNA复性等体积酚氯仿溶液作用：（除去蛋白质）无水乙醇作用：析出质粒DNA4. 凝胶电泳的原理：当一种分子被置于电场中，它们就会以一定的速度移向适当的电极。这种分子在电场作用下的迁移速度叫做电泳的迁移率，它同电场的强度和电泳分子本身携带的净电荷成正比。5. 凝胶电泳的种类：琼脂糖凝胶电泳，聚丙烯酰胺凝胶电泳，脉冲场凝胶电泳6. 琼脂糖凝胶电泳原理：琼脂糖凝胶电泳就是以琼脂糖大网孔型凝胶为支持介质，利用电荷效应和相对分子质量大小来分离不同的大分子的一种电泳技术。7. 琼脂糖凝胶电泳步骤： 制备1%琼脂糖凝胶；胶板制备；将DNA样品与上样缓冲液混合在一起，点样；:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳；在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带。8. SDS-PAGE原理：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中， 与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。9. SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？：聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关； 浓缩胶（trisHCL系统选择pH6.7）作用：使被分离蛋白质聚集在一起，浓缩为一狭窄的区带，使其于同一起跑线开始跑电泳；分离胶（trisHCL系统选择pH8.9），用来分离蛋白质；TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固； 十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。10. 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：聚丙烯酰胺凝胶通过丙烯酰胺单体和交联剂N，N-亚甲双丙烯酰胺经过聚合而形成的高分子聚合物。丙烯酰胺凝胶电泳可根据电泳样品的电荷、分子大小及形状的差别达到分离目的，兼具分子筛和静电效应，分辨力高于琼脂糖凝胶电泳。可分离只相差1bp的DNA片段，用于检测小相对分子质量的DNA或RNA。11. 脉冲场凝胶电泳是专门针对大片段DNA的分析检测方法。12. 分子杂交基本原理：具有一定同源性的两条核酸（DNA或RNA）单链在适宜温度及离子强度等条件下，可按碱基互补配对原则高度特异地复性形成双链。这是目前应用最广泛的一种重组子筛选方法，只要有现成可用的DNA或RNA探针，就可检测克隆子中是否含有目的基因。13. 分子杂交基本做法：将待测核酸变性后，用一定的方法将其固定在硝酸纤维膜（或尼龙膜）上，这个过程也称核酸印迹转移，然后用经标记示踪的特异性核酸探针与之杂交结合，洗去其他的非特异性结合核酸分子后，示踪标记将指示待测核酸中能与探针互补的特异DNA片段所在的位置。14. 分子杂交法可分为：Southern 印迹杂交、 Northern 印迹杂交、Western印记杂交（检测蛋白质）、斑点印迹杂交和菌落原位杂交等。15. 分子杂交探针有：同源或部分同源探针，总cDNA探针， 特异性cDNA探针，人工合成的寡核苷酸探针。16. E.coli感受态细胞制备过程：培养生命活动旺盛的菌体活化菌种扩大培养至A600=0.4收集菌体，4C预冷，5000rpm离心5min缓冲液处理（50100mM CaCl2 ；10mMTris-Cl；pH8.0）悬浮菌体冰浴15min 4C 5000rpm离心5min重悬菌体17. 三亲本杂交概念：将具有接合转化功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的供体细胞中，然后将该供体细胞与受体细胞混合，促使两者发生接合转化作用，将重组质粒导入受体细胞。由于上述整个接合转化过程涉及到三种有关的细菌菌株，即待转化的受体菌、含有要转化的重组质粒DNA的供体菌和含有广泛宿主的辅助质粒的辅助菌，故称为三亲本杂交接合转化法。18. 重组DNA分子导入真核细胞的方法：导入植物细胞：农杆菌转化法；基因枪法；导入动物细胞：显微注射技术；脂质体法。19. RNAi的概念：是由双链RNA分子在mRNA水平阻断相应基因表达或使其沉默的过程。20. RNAi的作用机制:(它利用了由小分子RNA引起的生物细胞内同源基因的特异性沉默现象，其本质是小分子RNA与对应的mRNA特异结合、降解，从而阻止mRNA的翻译。) 长链dsRNA被切割成20-25nt长度的片段，即siRNA。siRNA与核酸诱导的沉默复合物（RISC）结合，作为模板识别目的mRNA。通过碱基互补配对原则，mRNA与siRNA中的反义链结合，置换出正义链。双链mRNA被相关酶切割产生22nt左右的siRNA，后者与RISC结合，继续反复切割mRNA，从而使基因沉默。21. miRNA的概念：是在真核生物中发现的一类内源性的影响基因表达、细胞周期调控和个体发育的非编码RNA，由非编码基因转录物形成的茎环结构加工而来，其大小长约22个核苷酸；成熟miRNA的5端为磷酸基团，3端为羟基；表达具有严格的时序性和组织特异性； 无ORF，多存于间隔区，进化中结构高度保守。22. miRNA的作用机制：第七章 基因操作中大分子的分离和分析1. 生物芯片的概念：是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机（CCD）对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量。2. 生物芯片的分类： 按载体材料分：玻璃芯片，硅芯片， 陶瓷芯片按点样方式分：原位合成芯片，微矩阵芯片，电定位芯片按芯片固定的分子类型分类：基因芯片，蛋白质芯片，芯片实验室（lab-on-chip）3. 基因芯片的分析流程：样品及其标记处理芯片制作分子杂交信号检测数据处理及分析4. 基因芯片应用的关键技术：微阵列制作技术，探针杂交技术，扫描分析处理技术5.基因芯片有高速度、高通量、集约化和低成本的特点。第八章 PCR技术及其应用1. PCR的概念：指通过模拟体内DNA复制的方式，在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术，它包括变性、退火、延伸三个步骤。2. PCR基本要素：引物，dNTP ，耐热DNA聚合酶，模板DNA（,Mg2+）3. PCR具体步骤:变性（denaturation）：9098； 退火（annealing）：37 72 （具体取决于引物长度和碱基组成）； 延伸（extension）：72 。4. 耐高温DNA聚合酶的种类、各自的特点：Taq DNA聚合酶：（来自嗜热古细菌Thermus aquaticus）具较强的53DNA聚合酶活性和较弱的53外切酶活性，缺乏3 5外切酶活性，故保真度低，常用于重组子检测。 Pfu DNA 聚合酶：（来自激烈热球菌Pyrococcus fariosus）3 5外切酶活性，保真度较高。KOD DNA 聚合酶：具有强力的35核酸外切酶活性，与Taq DNA聚合酶相比，保真度比后者高50倍左右。合成速度比Taq DNA聚合酶快2倍，比Pfu DNA聚合酶快6倍。耐热性比Taq DNA聚合酶好，在100、1小时的热处理后仍可保持约70的活性，故根据需要可以将热变性步骤的温度设定值提得更高，这对处理GC含量高的模板等具有特异性高级结构的样品非常有利。5. PCR平台期的概念：6. PCR出现平台期的原因:后期循环酶浓度或聚合时间不足；引物耗尽；dNTP耗尽；产物浓度过高，以致dsDNA解链后又迅速退火，不能与引物结合;酶活性降低。7. PCR产物克隆的几种方式 ：在PCR产物两端添加限制性酶切位点：在设计引物时，除了考虑正常的特异性序列外，在引物的 5 末端添加酶切位点的序列以及保护序列。（在选择酶切位点的种类时，要保证所选的酶切位点在扩增的 DNA 片段内部不存在。如果对扩增的 DNA 片段的序列不清楚，可优先选用切割频率相对较少甚至酶切位点为 8 个碱基序列的酶切位点。）A/T克隆法：Taq DNA 聚合酶具有末端转移酶的活性，可在 DNA 片段的 3 末端添加一个核苷酸，通常为 A 。因此，Taq DNA 聚合酶扩增的产物可与 T-载体进行粘端互补连接，达到高效克隆的目的。平末端DNA片段的克隆：用于克隆具3-5外切活性的DNA聚合酶扩增的PCR产物。 长片段DNA的PCR扩增：通过改进缓冲体系和采用混合型DNA聚合酶来提高扩增效率。8. PCR扩增未知片段的几种方式：反向PCR：（是一种简单扩增已知序列周边未知序列的方法）用一直片断没有的限制性内切酶消化待测线性DNA模板；再将没切后的DNA片段连接成环状分子，其中至少有一个环状分子含有完整的已知片段；用与已知序列两端互补的一对引物进行PCR循环，扩增出未知序列。利用接头的PCR：（主要用于mRNA的PCR扩增）热不对称交错PCR：9. RACE的概念：通过PCR进行cDNA末端的快速扩增的技术：5RACE的原理 3RACE的原理 10. DD-PCR的概念：差异显示PCR，是一种用于检测相似生物材料的基因表达谱差异的一种方法，可以检测几乎所有表达的基因。 基本原理：所有真核生物的成熟mRNA都含有不同长度的poly(A)尾巴,根据poly(A)内部的2个核苷酸排列的不同,可以将所有的mRNA分子分为12类（见左图）。根据这12种mRNA序列可合成12种相应的反转录引物，即MNTTTTTTTT, 用其分别进行反转录,即可将所有mRNA分类合成12种cDNA，然后再用随机引物,以这12种cDNA分别做模板进行PCR扩增（见中图和右图），那么与表型相关的mRNA就很容易被发现并克隆出来。 11. RAPD的概念：随机扩增多态性DNA，是以单一的随机引物（一半由10个碱基），利用PCR技术随机扩增未知序列的基因组DNA获得的PCR片段。 原理：以人工合成的的随机寡核苷酸（通常为910nt）片断为引物，以基因DNA为模板进行PCR扩增，这样这一引物介导DNA成几何级数扩增，不同个体之间出现遗传上的多态性。所得的多态性DNA经琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，表现出用EB染色或银染即可检测的扩增产物。12. AFLP的概念：扩增片段长度多态性，是针对基因组 DNA 的限制性酶切片段进行选择性 PCR 扩增从而建立 DNA 指纹的技术。原理：首先将基因组 DNA 以两种限制性内切酶完全切割，然后将合成的并与这两个限制酶产生的末端相对应的接头与酶切 DNA片段的两端连接。然后以含有接头序列和酶切位点序列的引物，对连接产物作 PCR 扩增。最后利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行 PCR 产物分离，从而产生 DNA 指纹。第九章 DNA序列分析1. 两种不同的测序方法的基本原理 化学降解法基本原理：将待测DNA片段的5端磷酸基团作放射性标记，再分别采用不同的化学方法对特定碱基进行化学修饰并在该位置打断核酸链，从而产生一系列5端被标记的长度不一且分别以不同碱基结尾的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过并列点样的方式用凝胶电泳进行分离，再经放射自显影，即可读出目的DNA的碱基序列。 Sanger双脱氧链终止法基本原理：双脱氧核苷酸（ddNTP）分子的脱氧核糖的3位置的羟基缺失，当它与正常核苷酸混合在同一个扩增反应体系中时，在DNA聚合酶的作用下，虽然它也能参与DNA合成，但由于其3位置的羟基缺失，使其下面的核苷酸的5磷酸基无法与之结合。也就是说，一旦双脱氧核苷酸整和到正在合成的DNA链中，该股DNA的合成就到此终止。当向该反应体系中加入一种dNTP后，在DNA合成过程中ddNTP将与相应的dNTP竞争掺入到新合成的DNA互补链中。如果ddNTP 掺入其中，DNA互补链则到此终止，以此产生以不同碱基结尾的DNA片段，这些以特定碱基结尾的片段群通过并列点样的方式用凝胶电泳进行分离，再经放射自显影，即可读出目的DNA的碱基序列。2. 序列分析的基本步骤：模板制备和引物设计：模板：单链或双链DNA，必须保证足够的浓度；引物：18-22nt，55-60，尽量避免3个以上碱基重复，尽量减少发夹结构形成的可能性，多数情况采用通用引物测序。经典测序方法的反应步骤：模板变性退火标记（在DNA合成过程中掺入标记的核苷酸，如：-32PdATP，或者标记引物的5端磷酸基团，通过多核甘酸激酶将-32PrATP中的标记核苷酸转移到引物的5末端。） 延伸随机终止电泳分析和数据读取3. 全自动测序用4种不同的罗丹明荧光染料分别标记4种双脱氧核苷酸。4. 大片段DNA序列测定的方法通用引物指导未知序列的测定：引物步移随机克隆测序缺失克隆测序第十章 DNA诱变1. 定向进化的概念：对于某些实验目的，一次突变很难获得满意的结果，通常采用反复多次诱变和循环，其目的是获得满足人们需要的性能改良的蛋白质，又称为试管进化。2. 増变菌株的概念：与DNA错配校正功能和DNA损伤修复有关的基因突变后，细胞内基因的突变频率大大增加，这样的菌株叫增变菌株。3. 随机诱变的方法、原理：错误掺入诱变：通过改变PCR反应条件来调整PCR反应中突变的频率，降低聚合酶固有的突变序列倾向性，提高突变谱的多样性，使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中，从而得到随机突变的DNA群体，最后用合适的载体克隆突变基因。增变菌株诱变：将携带突变目的基因的质粒导入増变菌株中扩增若干代，即可得到随机突变体库，再将该库的重组DNA转化到或亚克隆到正常宿主中筛选、鉴定突变体。盒式诱变：包括盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变，简单的盒式取代诱变是通过限制性酶切除去特定的双链DNA片段，再与含有突变的单一序列双链寡核苷酸连接,得到取代突变，是一种定点诱变。混合寡核苷酸诱变：若用于取代的是含有随机突变的混合双链寡核苷酸，则可在限定区域内引入大量的随机突变。 化学诱变：用化学诱变剂处理双链DNA片段，将发生随机突变的片段群体克隆到合适的宿主中，构建成一个重组突变体库。用适当的功能分析可鉴别携带突变的重组子。4. 体外重组的种类、概念、特点：DNA shuffling技术是通过对一组序列相关DNA序列，经过超声波处理或在DNaseI的作用下随机切成小片段，纯化一定大小的片段，然后在没有引物的情况下，纯化片段互为引物进行重新组装；随着循环数的增加，PCR产物将越来越接近切割前的目的基因的长度；最后用基因两侧的引物合成全长的基因。优点：可在短时间内通过重组有效的突变体发掘所有可能的重组体与突变序列，从而大大加快进化速度；而且对可操作的靶序列没有任何要求，长度可达几十kb;通过多轮筛选或选择，可以使有益突变迅速积累，导致功能的明显提高；从表型上早期进行选择，而不必了解DNA片段上序列的信息，简化了操作程序；比随机突变显著提高了良性突变的概率。缺点：功能鉴定是此技术的瓶颈，故仅适用于抗性基因的体外重组。交错延伸重组：是一种简化的DNA shuffling技术。它不是由短片段组装全长基因，而是在PCR样反应中将含不同点突变的模板混合，随之进行多轮变性、短暂（5sec）复性/延伸反应，在每一轮PCR循环中，那些部分延伸的片段可以随机地杂交到含不同突变的模板上继续延伸，由于模板转换而实现不同模板间的重组，这样重复直到获得全长基因片段，重组的程度可通过调整反应时间和温度来控制。随机引发重组（RPR）：以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点的短DNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少量的点突变，在随后的PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整的基因长度。特点：可以用一条DNA单链为模板，因此可以直接以cDNA为模板进行随机引发重组。5. 传统的定点诱变的方法、原理：Kunkel定点诱变法（又称“U”法）：dut-：dUTP酶（dUTPase）缺陷，细胞不能把dUTP转化为dUMP，因此细胞内dUTP的含量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正常情况下由T占据的位置。ung-：UDG酶缺陷，UDG酶尿嘧啶-N-糖基化酶可除去掺入DNA中的尿嘧啶残基。该方法在制备单链模板时采用dut- ung-合成的DNA中部分胸腺嘧啶被尿嘧啶取代，在体外用诱变引物合成的杂合双链DNA在导入正常ung+ dut+菌株后，只有带有突变位点的新合成链和作模板进一步复制，而野生型不能复制。这样能够生长的细胞就带有突变位点。位点选择诱变：使用了2个寡核苷酸引物，一个是用来引入突变的引物，另一个是用来选择用的。选择性引物可用来恢复有缺陷的抗生素抗性基因，同时可用来选择引入突变的DNA链。但该方法需要特定的载体，即含有一个缺陷的抗生素抗性基因。转化子诱变：也使用了2个寡核苷酸引物，除了突变引物外，还使用了1个用来剔除单一酶切位点的引物。将待突变的DNA片段装载到克隆载体上，该载体上必须存在1个单一酶切位点。当这两个引物同时指导DNA合成时，突变的DNA链将不再含有该单一酶切位点，而模板DNA在该位置能被切割。通过转化大肠杆菌，线性化的模板DNA不能复制，只有突变保持环状，可以获得转化子。6. PCR介导的定点诱变的方法、原理：大引物PCR诱变：重叠延伸PCR诱变：重叠延伸剪接技术： 双向PCR快速定点诱变：7. PCR介导的定点诱变方法中，模板DNA的排除方法：限制性内切酶 DpnI 可特异性切割dsDNA中的Gm6ATC位点，对半甲基化的DNA效率较低，完全不能切割非甲基化DNA。从大肠杆菌体内分离的DNA模板已在体内的内源性Dam甲基化酶催化下完全甲基化，对DpnI 敏感。因此作为PCR产物的DNA在体外合成，没有甲基化，可以抵抗DpnI的切割。8. 无酶克隆定点诱变：第十一章 基因文库构建和目的基因的克隆1. 基因组DNA文库的概念：将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体重组并转化相应的宿主细胞，获得的所有阳性菌落，称为该生物基因组文库。2. cDNA文库的概念：将某种生物体基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体称cDNA文库。代表生物某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因，并不代表该生物的全部基因。3. 基因组DNA文库的构建流程及注意事项载体DNA的制备（载体的制备要求：纯度高；去磷酸化好）；高纯度大分子量基因组DNA的提取（要求：制备的DNA的长度为100-200kb，防止在制备过程中的机械断裂）；基因组DNA的部分酶切（选择四个bp识别位点的限制酶）与脉冲电泳分级分离；载体与外源片段连接（质粒载体可承载15kb DNA左右片段 (有效的范围为10kb)；l载体可承载25kb DNA左右片段(有效的范围为15 kb)；Cosmid 载体可承载45kb DNA左右片段(有效的范围为40 kb) ）与转化或侵染宿主细胞（在电转化和包装侵染过程中，首先选择转化效率高的感受态细胞或效价高且质量稳定的包装蛋白；同时，研究表明对连接产物进行脱盐处理也可以明显地提高其效率。另外，对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入片段的 DNA 的转化效率也有所不同）；重组克隆的挑选和保存；文库的质量检测4. 鸟枪法：利用机械剪切力和超声波等物理方法或限制性核酸内切酶酶切等生化方法将生物chr.打断，随后通过T4 DNA连接酶把这些片段与适当的质粒载体进行重组，转化受体菌后进行无性繁殖，获得一大群含不同外源DNA片段的克隆，再用简便的筛选方法从众多的转化菌株中筛选出含有某一目的基因的菌株，从中获得所要的基因。、5. 文库的代表性：指文库中所有克隆所携带的DNA片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可以从该文库中分离任何一段DNA。6. cDNA文库的构建步骤？细胞总RNA的提取和mRNA的分离：在固体支持物表面共价固定一段 oligo（dT）链，与Poly（A）尾巴退火，将 mRNA分离出来。cDNA 第一链的合成：通常用Oligo（dT）引物与mRNA3-末端的poly-A配对，应道反转录酶以mRNA为模板合成cDNA 第一链。cDNA 第二链的合成：自身引导法：先用氢氧化钠消化杂合双链中的 mRNA 链，解离的第一链 cDNA 的 3-末端就会形成一个发夹环，引导 DNA 聚合酶复制出第二链，再利用 S1 核酸酶将连接环切除形成平末端。置换合成法：微量的RNaseH将mRNAcDNA 杂合双链中的 mRNA 链切割成很多的小片段；大肠杆菌 DNA 聚合