分子发光分析法(2).pptVIP

2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,分子发光：处于基态的分子吸收能量(电、热、化学和光能等)被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。发光分析 包括荧光、磷光、化学发光、生物发光等。 物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光。,第六章 分子发光分析法,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，1575年他提到在含有一种称为“Lignum Nephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色。,一、概述,第一节 荧光分析法,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。 1867年，Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝桑色素配合物的荧光进行铝的测定。 19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一台荧光计。,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,荧光分析的特点： 灵敏度高：视不同物质，检测下限在0.10.001g/mL之间。可见比UV-Vis的灵敏度高得多。 选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。 结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。 应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测量的因素较多。,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,二、基本原理 1、分子的激发态和基态：不论是分子轨道还是原子轨道上的电子都有一套特有的描述其运动状态的量子数。 根据Pauli Exclusion Principle，每个轨道上最多容纳2个自旋方向相反的电子。 s = + 1/2 or - 1/2 总自旋量子数：S = si,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,能级的多重性：2S1 当S0时，即2S11，称为单重态； 当S1/2时，即2S12，称为双重态（只有一个电子）； 当S1时，即2S13，称为叁重态 基态单重态S0 基态双重态D0,基态,基态,激发态,激发态,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,激发单重态 S1 激发叁重态 T1,Multiplicities: S0 - common, diamagnetic (not affected by B fields) D0 - unpaired electron, many radicals, two equal energy states T1 - rare, paramagnetic (affected by B fields) (T0 - doesnt exist, not ground state),激发态,激发态,基态,基态,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,分子的电子能级示意图,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,注意: （1）没有基态叁重态； （2）从S0到T1的跃迁是禁阻的； （3）Energy(S1)Energy(T1) (difference is energy required to flip electron spin)； （4）多数分子含有偶数电子，分子的电子基态多为单重态； （5）叁重态有顺磁性。,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,2、荧光的产生,hv,回到基态，如何回去？,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,S2,分子的吸收情况,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,S2,振动弛豫：在同一电子能级（激发态）,特点：无辐射；速率快（10-1410-12 s内完成）,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,S2,内转移（internal conversion) ：相同多重性的两个电子能级之间的非辐射跃迁,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,内转移的特点 （1）无辐射； （2）速率取决于两个能级之间的能量差，相邻单重激发态之间能级接近，振动能级常常发生重叠，内转移很快； （3）分子无论被激发到哪一个电子激发态，在10-1310-11 s内经内转移和振动弛豫都会跃迁到最低的电子激发态的最低振动能级上； （4）So到S1的能级差较大，内转移的速率相对较小，故S1的寿命较长。,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,S2,l3,荧光发射,Fluorescence,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,S2,系间窜跃,磷光发射,l4,Intersystem Crossing,Phosphorescence,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,磷光发射的特点 （1）禁阻跃迁，发光速率慢，持续时间长10-4100s； （2）从T1也有回到S1，然后S1到S0发出荧光，叫延迟荧光； （3）电子由S0到T1几率极小，是禁阻跃迁。 外转移：指受激分子与溶剂或其它分子的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强度减弱或消失的过程。,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,外转移 External Conversion,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,系间窜跃,l3,延迟荧光,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,三. 分子荧光(磷光)光谱,1. 荧光(磷光)激发光谱与发射光谱,荧光(磷光)均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不同波长的荧光。,A. 激发光谱,固定em=620nm(MAX),ex =290nm (MAX),固定发射波长 扫描激发波长,荧光激发光谱与紫外-可见吸收光谱类似,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,固定em=620nm(MAX),固定ex=290nm (MAX),em= 620nm(MAX),B. 发射光谱(荧光光谱),固定激发波长 扫描发射波长,C. 激发光谱与发射光谱的镜像关系,发射光谱的形状与激发波长无关：,分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即使分子被激发到高于S1的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到S1电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,D.磷光光谱,与发射光谱相同条件下的磷光光谱,激发光谱,发射光谱,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,四、荧光效率及其影响因素 1、荧光效率：物质吸收了紫外可见光后，跃迁至激发态，激发态分子是以辐射跃迁还是以非辐射跃迁弛豫，决定了物质能否发荧光。 荧光效率指的是以辐射跃迁弛豫的分子数目占总激发态分子数目的比例。 FfNfluoresence/Nexcited （0.01.0）,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,Ff越大，表示辐射跃迁的概率越大，发光强度越大！ 以各种跃迁的速率常数（荧光发射，VR，IC，isc等）来代替N表示Ff，得 Ffkf/（kf+Ski） 其中：kf表示荧光发射过程的速率常数； Ski表示其它非辐射跃迁过程的速率常数之和。 一般而言，kf主要取决于分子结构。而Ski 主要取决于化学环境。,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,1. 跃迁的类型,五. 荧光与有机化合物的结构,对于有机荧光物质:, * ,n * max 100 平均寿命10-510-7sec,* max104 平均寿命10-710-9sec kS T小,* n,* 是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。,强荧光的有机化合物具备下特征: 具有大的共轭键结构； 具有刚性的平面结构； 具有最低的单重电子激发态为S1为 * 型； 取代基团为给电子取代基。,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,2. 共轭效应,产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，离域大键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。,荧光物质的刚性和平面性增加，有利于荧光发射。,3. 刚性平面结构,芴,联苯,F=1,F=0.2,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,不产生荧光,产生荧光,产生荧光,不产生荧光,F=0.92,萘,VA,F(萘)= 5F(VA),荧光黄,酚酞,偶氮菲,偶氮苯,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,1）给电子取代剂加强荧光,4. 取代基效应,HN2， NHR ， NR2， OH， OR ， CN,产生 p 共轭,二苯甲酮：弱荧光、强磷光 S1 T1的系间窜跃产率接近1,2）得电子取代基减弱荧光、加强磷光,C=0， COOH ， NO2,不产生 p 共轭,硝基苯：不产生荧光、弱磷光,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,空间位阻对荧光发射的影响,3）取代基的位置,反式二苯乙烯 强荧光物质,F=0.75,F=0.03,立体异构体对荧光发射的影响,顺式二苯乙烯 非荧光物质,电离效应对荧光发射的影响,pH=1, 有荧光,pH=13, 无荧光,无荧光,有荧光,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。,5.重原子取代基效应,Cl， Br ， I,S1 T1的系间窜跃由于重原子的存在增强,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,6、环境因素对荧光的影响： （1）溶剂的极性：电子激发态比基态的极性大，溶剂的极性增强，荧光强度增大，荧光波长红移。,巯基喹啉在不同溶剂中的荧光峰和荧光效率,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,（2）温度：温度升高，Kf不变，但非辐射跃迁的速率常数增大，是故荧光效率降低。 （3）pH值：含酸性或碱性取代基的化合物荧光性质受pH的影响。 如：,无荧光,蓝色荧光,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,再如：,无荧光,蓝色荧光,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,（4）表面活性剂：有利于荧光发射。 （5）O2的存在：O2为顺磁性分子，溶液中溶解氧的存在，常常导致荧光降低，甚至熄灭，这可能是处于单重激发态的荧光物质的分子相互作用，加速系间窜跃（几率增大）所致。,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,六. 分子荧光(磷光)强度与荧光物质浓度的关系,1. 荧光强度(磷光)与浓度的关系,光吸收定律（Lambert Beer Law）,相应的吸光分数为：,荧光强度（IF）与相应的吸光分数成正比：,按照级数展开式：,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,对于稀溶液，当 bc0.05（磷光 bc0.01）时：,IF-荧光强度 F-荧光量子产率,k-与仪器灵敏度有关的参数 I0-入射光强度。,IP-磷光强度 P-磷光量子产率,b-吸收光程 -摩尔吸光系数 C-荧光物质浓度,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,但在高浓度时，If KC不成立,If,C,原因： （1）高次项 （2）自熄灭现象，自吸收现象,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,七、 荧光光谱仪,（一）. 主要组成及部件的功能,荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图,光源,氙灯,激发单色器,样品池,光电倍增管,数据处理 仪器控制,发射单色器,问题：荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计有何异同点？,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,（二）. 光源,1. 光源的要求：,发射强度足够且稳定的连续光谱 光辐射强度随波长的变化小 有足够长的使用寿命,2.氙灯光源,常用气体放电灯类型： 氙灯光源 高压汞光源,波长范围：2001000nm 工作压力：520 atm 启动电压：2040KV 使用寿命：10002000h,最广泛应用的连续光源： 发射波长范围宽 发射光强度大,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,3. 高压汞灯光源,应用广泛的线光源： 253.7 296.5 302.2 312.6 313.2 365.0 365.5 366.3 404.7 435.8 546.1 557.0 579.0 (nm ),2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,（三）. 单色器,平面衍射光栅,线色散率,聚光本领,分辨率,（四）. 检测器,光电倍增管 放大倍数：2n5n;n=10,103107， 最大108109,（五）.样品池：液池、荧光池,1.样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样,2. 吸收池的形状：紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光 荧光分光光度计的样品池四面透光,波长范围,3. 使用注意事项,容易破碎,问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？,沾污问题,闪跃特性,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,在紫外光照射下会发生荧光的无机化合物很少，主要依赖于有机试剂形成的螯合物。,八. 荧光分析的应用,1. 无机化合物,直接荧光测定法,其中，较常测定的元素有：Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd与某些稀土元素；测定的灵敏度有些可以达到10-10;,自从1867年Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝桑色素配合物的荧光进行铝的测定以来，采用有机试剂可以测定70多种元素。,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,某些元素虽然不与有机试剂形成发荧光的配合物，但是它会与发荧光的配合物争夺配位体，组成不发荧光的配合，使其产生荧光熄灭，由荧光熄灭的强度此该元素的含量。 较常测定的元素有：F、S、Fe、Ag、Co、Ni、Cu、Mo、W,荧光熄灭测定法,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,催化荧光测定法,某些元素虽然与有机试剂形成发荧光的配合物，但是反应速度慢，在某些微量元素的催化下，反应速度会加快，在特定的时间内可用来测定微量元素。,常测定的元素有：Cu、Be、Fe、Co、Os、Ag、Au、Zn、Al、Ti、V、Mn、Er、H2O2、CN,某些微量元素存在，会催化发荧光的配合物产生荧光熄灭，在特定的时间内可用来测定微量元素。,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,较常测定的元素有：Cr、Nb、U、Te、Pb,低温荧光测定法,溶液温度的降低，显著增强溶液的荧光强度。液氮 1960C,较常测定的元素有：Ce、Sm、Tb 等稀土元素 Sb、V、Pb、Bi、Nb、Mn,固体荧光测定法,固体荧光发在荧光分析中也经常用到。,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,芳香族化合物存在共轭的不饱和体系，是有机化合物荧光测定的主要类型。,. 有机化合物,3. 生命与生物物质,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,化学发光分析法的简介 1、概述：某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由激发态回到基态时，便发出一定波长的光。这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光。利用化学发光反应而建立起来的分析方法称为化学发光分析法。,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,化学发光也发生于生命体系，这种发光称为生物发光。,萤火虫发光,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,2、化学发光分析的基本原理 化学发光是吸收化学反应过程产生的化学能，而使反应产物分子激发所发射的光。任何一个化学发光反应都应包括化学激发和发光两个步骤，必须满足如下条件： （1）化学反应必须提供足够的激发能，激发能主要来源于反应焓，170300 KJ/mol。 （2）反应途径要有利于激发态产物的形成，使化学反应的能量至少能被一种物质所接受并生成激发态。,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,（3）激发态分子跃迁回基态时要释放光子，而不是以热的形式释放能量。 问题： i、有多少参加化学反应的分子被激发？ ii、是不是所有的激发态分子都发光？ iii、综合起来，参加化学反应的分子有多少发光？,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,i、有多少参加化学反应的分子被激发？ 定义： r为生成激发态分子的化学效率激发态分子数/参加反应的分子数 r取决于化学反应，对于特定的反应在一定的实验条件下化学效率为常数。,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,ii、是不是所有的激发态分子都发光？ 定义： f为激发态分子的发光效率发射的光子数/激发态的分子数 f的影响因素：（1）发光体本身的结构和性质；（2）环境。,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,iii、参加化学反应的分子有多少发光？ 定义： cl为化学发光效率发射的光子数/参加反应的分子总数 clr f 最高效率为100：生物发光 化学发光的效率一般小于5。,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,化学发光强度Icl 化学发光反应的发光强度Icl是以单位时间内发射的光子数表示。它与化学发光反应的速率有关，而反应速率又与反应分子浓度有关。即： Icl（t） cl dc/dt Icl（t）表示t时刻的化学发光强度，dc/dt是分析物参加反应的速率。,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,对上式积分 发光强度与分析物浓度成正比。,也可以用峰高定量！,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,3、化学发光反应的基本类型 按反应体系的状态分类，如化学发光反应在气相中进行称为气相化学发光；在液相或固相中进行称为液相或固相化学发光；在两个不同相中进行则称为异相化学发光。 （1）气相化学发光 主要有O3、NO、S的化学发光反应，可用于监测空气中的O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等。,2010.09.03,化学化工学院分析化学教研室,例如：