培养条件对发酵的影响.ppt

第4 章 培养条件对发酵的影响,4.1 培养基 4.2 接种和菌种扩大培养 4.3 培养基灭菌 4.4 温度 4.5 供氧和二氧化碳 4.6 空气除菌 4.7 pH 4.8 消泡 4.9 防止杂菌污染 4.10 植物细胞培养 4.11 动物细胞培养,4.1 微生物培养基 (Culture medium),4.1.1 培养基成分 4.1.2 培养基的种类 4.1.3 培养基的优化 4.1.4 影响培养基质量的因素 4.1.5 培养基灭菌技术,4.1.1 培养基成分 (Medium proposition),培养基定义： 微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。 培养基的重要性： 微生物的生长； 产物的合成； 工艺路线及工艺设备的选择； 产品的质量和产量； 影响生产成本；,发酵培养基的组成(composition),碳源：糖类、脂肪、某些有机酸、醇或碳氢化合物。 氮源：花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等。常用的无机氮源有氨水、硫酸铵、氯化铵、硝酸盐等。 无机盐类：镁、硫、磷、铁、钾、钙、钠、氯、锌、钴、锰等 生长因子(growth factors)：维生素，如生物素， 前体物(precursors)：被菌体直接用于药物合成而自身结构无显著改变的物质称为前体。,（1）碳源( Carbon source),碳源是组成培养基的主要成分之一。 碳源的主要作用： 供给菌种生命活动所需要的能量； 构成菌体细胞成分； 用于合成代谢产物； 碳源的其它作用： 客观上也是调节维持pH的成分。 调节渗透压。,碳源如何影响pH,微生物利用糖份作碳源时，如果供氧不足，造成有机酸积累。 pH下降。 微生物利用脂肪作碳源时，需要更多的氧，如果供氧不足，造成有机酸积累。 如果醋酸钠作为碳源，引起pH上升。 CH3COONa+2O2 2CO2 +H2O +NaOH,糖类,葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖和淀粉等是药物发酵生产中常用的碳源。 发酵过程中过多的葡萄糖会加速菌体的呼吸，如果此时通风不足，致使培养基中溶解氧不能满足菌体的需要，会使一些酸性中间代谢物如乳酸、丙酮酸、乙酸等积累，使培养基pH降低，从而抑制微生物的生长和产物的合成。 细菌，酵母菌一般都只能利用简单的单糖。 淀粉是霉菌和放线菌容易利用的碳源。,淀粉(Starch),淀粉分玉米淀粉、甘薯淀粉、土豆淀粉和小麦淀粉等； 价格比较低廉，来源也较丰富； 微生物需有淀粉水解酶方可直接利用淀粉；大多数霉菌可直接利用碳源。 可利用水解制糖工艺将淀粉转化为糖类，供细菌酵母菌利用。,淀粉水解(hydrolase)工艺,酸水解： 酸-酶法： 双酶法：高温淀粉酶，糖化酶。 双酶法制糖主要过程：玉米淀粉原料出发，经配料，糊化，液化和糖化，脱色过滤，制备成淀粉水解糖。,酶法(Enzymatic)制糖,糊化：淀粉乳加热，淀粉颗粒膨胀，晶体结构消失，变成糊状液体，淀粉不再沉淀。 液化：利用淀粉酶(amylase)使糊化淀粉水解到一定的糊精和低聚糖程度，粘度大大降低，流动性增加。 糖化：（C6H10O5）n + nH2O = nC6H12O6 淀粉 (glucoamylase)水 162 18 180 1000 X=,DE值:用DE值表示淀粉水解的程度或糖化程度。糖化液中还原性糖以葡萄糖计，占干物质的百分比称为DE值。 DE值计算： DE= 还原糖浓度（C2）100% 干物质浓度（W1）糖液比重（d） 还原糖用裴林氏法等法测定，浓度表示：葡萄糖g/100ml糖液； 干物质用阿贝折光仪测定，浓度表示：干物质g/100g糖液。,淀粉糖制备(酸化法）,1. 调粉。在调粉桶内先加部分水（可使用离交或滤机洗水），在搅拌情况下加入淀粉原料，投料完毕，继续加水使淀粉乳达到规定浓度（40%），然后加入盐酸调节至规定pH值。 2.糖化。调好的淀粉乳，用耐酸泵送入糖化罐，进料完毕打开蒸气阀升压力至2.8kg/cm2左右，保持该压力35min。取样，用20%碘液检查糖化终点。糖化液遇碘呈酱红色即可放料中和。,3 中和。糖化液转入中和桶进行中和，开始搅拌时加入定量废炭作助滤剂，逐步加入10%碳酸钠溶液中和，要掌握混和均匀，达到所需的pH值后，打开出料阀，用泵将糖液送入过滤机。滤出的清糖液随即送至冷却塔，冷却后糖液进行脱色。 4 脱色。清糖液放入脱色桶内，加入定量活性炭随加随拌，脱色搅拌时间不得少于5分钟（指糖液放满桶后），然后再送至过滤机，滤出清液盛放在贮桶内备用。 5 离子交换。将第一次脱色滤清液送至离子交换滤床进行脱盐、提纯及脱色。糖液通过阳-阴-阳-阴4个树脂滤床后，在贮糖桶内调整pH值至3.84.2。,6 第一次蒸发。离子交换后，准确调好pH值的糖液，利用泵送至蒸发罐，保持真空度在500毫米汞柱以上，加热蒸气压力不得超过1公斤/厘米2 ，控制蒸发浓缩的中转化糖浆浓度在4250%左右。可出料进行第二次脱色。 7 二次脱色过滤。经第一次蒸发后的中转化糖浆送至脱色桶，再加入定量新鲜活性炭，操作与第一次脱色相同。二次脱色糖浆必须反复回流过滤至无活性炭微粒为止，方可保证质量。然后将清透、无色的中转化糖浆，送至贮糖桶。,8 第二次蒸发。该道操作基本上与第一次蒸发操作相同，只是第二次蒸发开始后，加入适量亚硫酸氢钠溶液（35波美度），能起到漂白而保护色泽的作用。蒸发至规定的浓度，即可放料至成品桶内。 上述的工艺操作规程，主要指特、甲级成品而言，如生产乙级成品的操作工序，只要求一次脱色和一次蒸发，而且有些操作指标也略有差异,双酶法制糖工艺 1 调浆配料槽；2，8过滤器；3，9，14，17，泵；4，10喷射加热器；5缓冲器；6液化层流罐；7液态液贮槽；11灭菌罐；12板式换热器；13糖化罐；15压滤机；16糖化液贮槽；18糖液贮槽,双酶法制备玉米粉水解糖液的 优化工艺,液化酶用量55l/100 g玉米粉(1 100 U/100 g玉米粉)； 液化时间89 min； 糖化酶的量400;l/100 g玉米粉(20 000 U/100 g玉米粉)； 糖化时间284 min； 淀粉转化率可达到93.95%.,氮源(Nitrogen source),氮源的主要功能： 构成微生物细胞物质 含氮代谢物的原料； 发酵液pH调节：在发酵罐中通入氨可起到双重作用。,有机氮源(organic nitrogen sources),有机氮源除含有丰富的蛋白质、多肽和游离氨基酸外，往往还含有少量的糖类、脂肪、无机盐、维生素及其某些生长因子。因而微生物在含有机氮源的培养基中常表现出生长旺盛、菌体浓度增长迅速的特点， 微生物在有机氮源培养基中，可直接利用氨基酸和其它有机氮化合物中的各种不同结构的碳架，来合成生命所需要的蛋白质和其它细胞物质，而无需从糖代谢的分解产物来合成所需的物质。,微生物对氨基酸利用的选择性,氮源直接作为药物的前提物。 某些氨基酸作为合成肽类抗生素的前体物质。 螺旋霉素发酵中，发酵培养基里加入L-色氨酸可使螺旋霉素的产量显著提高，但加入L-赖氨酸会完全抑制螺旋霉素的生物合成。 缬氨酸、半胱氨酸和氨基己二酸等就是合成青霉素和头孢菌素的主要前体；,蛋白胨（Peptone）,最常用的氮源，营养价值高。 用于蛋白胨生产的蛋白包括动物蛋白（酪蛋白、肉类）和植物蛋白（豆类）两种。 蛋白质经水解降解生成的多肽，二肽及复合氨基酸物。具有蛋白质的通性。 1.色泽：白色粉末或浅黄色粉末 2.总氮量：14.5%以上 3.水份5% 4.灰份：5%以下 5.总磷量0.2% 6.氯化物5% 7.pH值：5-7 。,牛肉膏(Beef Extract),采用新鲜牛肉经过剔除脂肪、消化、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有牛肉自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。 牛肉膏当中含有肌酸、肌酸酐、多肽类、氨基酸类、核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质。该产品广泛应用于生物制药发酵及各种培养基的制备。,酵母浸提物,酵母粉 (Yeast Extract powder) 酵母浸粉 采用新鲜酵母经酵母自溶、过滤、浓缩、喷雾干燥而得到的一种浅黄色至类白色干燥粉末。有酵母自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色。极具吸湿性， 酵母粉含有氨基酸类、肽类、水溶性维生素、及酵母多糖、酵母核酸组成的一种混合物，含有丰富的B族维生素和各种氨基酸。核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质。一般的用量为0.2%0.5%。 酵母膏 (Yeast Extract) 酵母浸膏 采用新鲜酵母经酵母自溶、过滤、浓缩而得到的一种棕黄色至棕褐色的膏状物。有酵母自然香味，易溶于水，水溶液呈淡黄色至浅棕色。含氨基酸类、肽类、水溶性维生素、及酵母多糖、酵母核酸组成的一种混合物，含有丰富的B族维生素和各种氨基酸。核苷酸类、有机酸类、矿物质类及维生素类的水溶性物质。一般的用量为0.2%0.5%。,黄豆粉（soybean meal),黄豆粉是发酵生产中常用的有机氮源。 根据油脂含量可将其分为三类： 全脂黄豆粉(含油脂18%)，低脂黄豆粉(含油脂9%)，脱脂黄豆粉(含油脂2%)。 低温提取油脂后加工制备；高温提取油脂后加工制备。 酶解大豆水解液的应用及优点。 棉籽饼粕，花生粕也是应用较广泛的有机氮源。,玉米浆(Corn Steep Liquor，简称CSL),玉米浆是用亚硫酸浸泡玉米的水经过浓缩加工制成的，呈鲜黄到暗褐色、浓稠不透明的絮状悬浮物，约含50%干物质； 玉米浆中含有较丰富的玉米可溶性蛋白，很容易被微生物利用。富含维生素。 由于玉米的来源，不同加工条件各异，因此，玉米浆的成分常有较大波动，在使用时应注意适当调配。 玉米浆粉的应用。,无机氮源(inorganic N source),多种放线菌、霉菌或细菌都能利用各种无机氮源为主要或辅助氮源， 常用的有硫酸铵、硝酸铵等。 铵盐中的铵氮可以直接被菌体利用来合成细胞中的含氮物质，硝基氮必须先还原成氨后，才能被利用，所以铵盐的利用比硝基快。,无机氮源的生理酸或生理碱物质,生理酸性物质：如硫酸铵 （NH4）2SO4 2NH3 + H2SO4 生理碱性物质，如硝酸盐 NaNO3 + 4H2 NH3 + 2H2O + NaOH,无机盐及微量元素,磷酸盐:核蛋白等重要细胞物质的组成部分，许多辐酶(或辐基)、高能磷酸键的组成部分 磷在菌体生长、繁殖和代谢活动中起着极其重要的作用，磷还可以防止青霉素的破坏， 过量的磷酸盐对某些抗生素合成产生抑制作用。 培养基中钙盐过多时，会形成磷酸钙沉淀，降低培养基中可溶性磷的含量， 当培养基中磷和钙均要求较高浓度时，可将两者分别消毒或逐步补加。,硫和铁,硫也是菌体细胞蛋白质的组成部分。它参与合成含硫氨基酸的元素，也是某些抗生素分子中的组成元素。含硫的氨基酸，如甲硫氨酸是甲基供体。 铁是菌体细胞色素、细胞色素氧化酶和过氧化物酶的组成元素，是菌体生命活动必须的元素之一。,微量金属无素,锌、镁、钴等离子是某些酶的辅基或激活剂。微量的锌对青霉素发酵有促进作用，但过量时对青霉素有破坏作用。 镁离子除了有激活一些酶的作用外，还可提高抗生素生产菌对自己所产抗生素的耐性。 钴离子也能激活一些酶，又是维生素B12的组成元素，发酵中加入一定量的钴盐，能使维生素B12的产量提高数倍。,前体物(precursors),前体物以整体结构加入到新合成的物质中。 在培养基中加入前体物可大大提高产物的浓度。 如何寻找到合适的前体物是培养基配方研究的重点。 青霉素的前体物质是苯乙酸及有关衍生物； 金霉素的前体物质是氯化物； 维生素B12的前体物是钴化物； 胡萝卜素的前体物是-紫罗兰酮，等等,促进剂,促进剂是指哪些既不是营养物又不是前体，但能提高产物产量的添加剂。 加入巴比妥盐能使利福霉素单位增加，并能使链霉菌推迟自溶，延长分泌期,抑制剂（inhibitor),加入抑制剂会抑制某些代谢途径的进行，同时会使另一代谢途径活跃，从而获得人们所需要的某种产物或使正常代谢的某一代谢中间物积累起来。 四环素发酵中，加入溴化剂(NaBr)能抑制金霉素形成的代谢途径，促进四环素的生成。,水,在液态发酵培养基中，水的比例最大。 水源：自来水，深井水，河水，不同地区的水源； 水质：主要是水中的杂质，尤其是微量元素的含量。 自来水管中的铁锈往往在不同时间含量不同。一般在早班时含量最高。,增加细胞通透性的物质,表面活性剂： 吐温-80； 曲拉通 Toluene TritonX-100 Span-20 但需注意是否残留在产品中，是否符合药品安全,4.1.2培养基的种类,培养基的种类与选择 培养基的类型： 按培养基组成物质的纯度，分为合成培养基和天然培养基(复合培养基)。 按培养基的状态，培养基可分为固体培养基、半固体培养基和液体培养基。 依据在生产中的用途(或作用)，可将生产上应用培养基分为孢子培养基、种子培养基和生产培养基。,(1)孢子(spore)培养基,孢子培养基是供菌种繁殖孢子的一种常用固体培养基，对这种培养基的要求是能够使菌体迅速生长，产生较多优质的孢子，并要求这种培养基不易引起菌种发生变异。 孢子培养基的基本配制要求： 营养不要太丰富(有机氮源)，否则不易产生孢子；如土豆葡萄糖培养基(PD). 所用无机盐的浓度要适量，否则会影响孢子量和孢子颜色； 要注意孢子培养基的pH和湿度。生产中常用的孢子培养基有麸皮培养基，大(小)米培养基，由葡萄糖(或淀粉)、无机盐、蛋白胨等配制的琼脂斜面培养基,(2) 种子(seed)培养基,种子培养基是供孢子发芽和菌种生长繁殖用的。营养成分应是易被菌体吸收利用的，同时要比较丰富与完全，其中氮源和维生素的含量要高些，但总浓度以略稀薄为宜以便菌体的生长繁殖。 种子培养基的营养成分是易于吸收的碳源和氮源，如葡萄糖、硫酸铵、尿素、玉米浆、酵母膏和蛋白胨等。 种子质量的好坏对发酵的影响很大，为了使培养的种子能够满足发酵的要求，必须将种子培养基和发酵的要求联系起来考虑。 最后一级种子培养基的成分应接近发酵培养基，可使种子进入发酵培养基后能迅速适应，快速生长。,(3)发酵培养基,发酵培养基是供菌种生长、繁殖和合成产物之用。它既要使种子接种后迅速生长，达到一定的菌体浓度，又要使长好的菌体能迅速合成所需产物。 发酵培养基的组成除有菌体生长所必需的元素和化合物外，还要有产物所需的特定元素、前体和促进剂等。但如果生长和生物合成产物需要的总的碳源、氮源、磷源等的浓度太高，或生长和合成两阶段各需的最适条件不同时，还应考虑补加培养基来满足发酵工艺的要求,4.1.3培养基的优化,培养基设计的原理： 根据微生物的性质选取营养物质的种类； 培养基的组分（来源和加工方法）；配比；缓冲能力，粘度，消毒是否彻底，是否破坏？原料中是否有不良杂质。 注意快速利用的碳(氮)源和慢速利用的碳(氮)源的相互配合,发挥各自的优势,避其所短。 要注意生理酸、碱性盐和pH缓冲剂的加入和搭配。,碳氮比,选用适当的碳氮比。培养基中的碳氮比的影响十分明显。氮源过多，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累；氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影响产量。碳源过多，则容易形成较低的pH，若氮源不足，易引起菌体衰老和自溶。 从碳氮元素分析来看，酵母菌细胞中碳氮比约为100:20；霉菌约为100:10；一般工业发酵培养基的碳氮比约为100:0.2-2.0（思考：为何低得多）。,碳氮比如何计算？,含碳化合物与含氮化合物： C/N比。重量比,摩尔比。 含碳原料中C含量的计算： 含N原料，氨基酸中的N计算： 蛋白质的原料（豆饼粉等）中N的计算：要根据粗蛋白质的含量，折算成N含量。 含N原料中，如有C的含量，也应计入C源总量。,培养基优化实验方法,一般采用摇瓶，小型发酵罐实验； 先进行单因素实验，最后再进行综合实验。 在选择培养基中使用的最适原材料种类和浓度配比时，经常采用的方法有单因子实验法、正交试验设计和均匀试验设计等。 采用正交试验设计或均匀试验设计等方法，可大大加快试验进程。,4.1.4 影响培养基质量的因素,原材料质量的影响 水质的影响 灭菌操作的影响 糖类在高温条件下易被破坏，特别是还原糖与氨基酸、肽类或蛋白质等有机氮源一起加热时，更容易产生化学反应，形成5-甲基糠醛和鬃色的类黑精。为避免糖类与其它成分在灭菌过程中相互接触，在生产中有时将糖和其它成分分别灭菌，,其他因素的影响,培养基的pH: pH对菌体的生物代谢有较大的影响。在工业上，通过改变培养基成分的配比，使在发酵过程中的pH变化适合菌种代谢的要求，或者直接加酸或碱调节。 培养基粘度：特别是用如淀粉、黄豆饼粉、花生饼粉等，所配制的培养基比较稠厚，对空气的利用、染菌率的控制以及各项参数的自控都不利，对提取精制也有影响。,4.2 菌种扩大培养,种子的概念 3.4.1 实验室种子培养 3.4.2 生产车间种子培养 3.4.3 接种龄与接种量 3.4.4 影响种子质量的因素 3.4.5 种子质量的控制措施,保存菌种的种类,菌种的保存方式：斜面菌；砂土管，低温保存，冷冻干燥管，液氮保存； 孢子悬浮液，液体种子，固体种； 菌种的活化：尤其是冷藏法保存的菌种需先培养一定时间再移接若干代。,菌种低温保藏设备,超低温冰箱（-85）和液氮瓶（-195）： 一般植物或微生物种子保存用超低温冰箱较多。 -85冰箱，要选择质量好的，尤其是冰箱压缩机的性能是最主要的指标。 冰箱所在地的电源应有保证。以防断电时间过长时引起菌种的衰退。电压稳定（故需要配稳压电源）。,冷冻菌种的复活,将冷冻或液氮保藏的菌种取出，迅速放入37水浴中解冻。一般需22.5min，等完全解冻后，用无菌吸管，在安瓿管内注入0.3-0.5ml的无菌生理盐水或1% 麦芽汁等适宜的液体培养基，轻轻振荡，使冻于菌体溶解呈悬浮状。取0.10.2ml菌体悬浮液，移植于适宜的琼脂斜面平板培养基上，剩余的菌液，注入适宜的液体培养基内，然后在建议的温度下培养。,菌种扩大培养过程,保存菌种（斜面种，沙土管，冻干管） 斜面种子（活化，培养） 摇瓶，茄子瓶斜面，固体培养基 种子罐（一级，二级，三级或四级）,4.2.1 实验室种子培养,对于细菌类种子，一般采用从斜面移接到三角摇瓶； 对于产孢子的菌种，可采用砂土管孢子，或冷冻管孢子等，接入固态培养基上，培养大量孢子； 对于不产孢子的放线菌或霉菌，也可在茄子瓶中大量培养菌丝体，或摇瓶培养。,孢子浓度与OD值的关系：,由于测定OD值比孢子数的测定更为简单，而孢子数与OD值存在一定的线性关系，故经过实验，可确定两者之间的关系。计算公式 Y= 80.79045X + 3.61871 （3-27） 式中 Y孢子浓度，个/mL； XOD750。,4.2.2 生产车间种子培养,实验室培养的菌悬液或菌丝体种子接入种子罐，一般采用压差法。孢子悬浮液一般采用微滤法。注意罐压应高于气压。 逐级扩大的种子罐； 种子罐级数的确定：依据菌种特性，孢子发芽数量，菌种繁殖速度，发酵罐容积等。 一般细菌类，可采用一级种子；生长慢的菌种，采用二级种子（发芽罐和繁殖罐二级）；,浅盘式种曲培养机,该种曲机分为两部分：培养室和附属装置。培养室是一个卧式的夹套式压力容器。培养室内有小车，车内放置1020个培养盘。曲料放在培养盘内。培养室内还设有循环室内空气用的风扇、种曲流向分配盘和加湿雾化器等。 附属装置包括种曲供给装置（二级种曲贮罐、无菌压缩空气供给装置）、空气供给装置（空压机、压缩空气贮罐、过滤器和灭菌装置）、真空吸引装置（水力喷射器，用于培养室内物料降温）、温度调节装置（控温台、温冷水调温装置和加湿装置）。,种曲培养机,4.2.3 接种龄与接种量,接种龄：以菌种处于旺盛的对数生长期，且菌体量未达到最高峰时为宜； 过于年轻的种子，造成前期生长慢，发酵周期长的后果；年老的种子，生产能力下降，菌丝过早衰老。 接种量：种子液体积与接种后培养液体积之比。决定于菌种的繁殖速度。接种量一般为5-15%。接种量多：缩短时间，产物提前合成；但太多，则影响产物合成。易形成菌丝球。,4.2.4 影响种子质量的因素,原材料的质量；原材料的产地，同一产地不同批次质量的波动； 培养条件：pH，温度，湿度，通气等。 斜面的冷藏时间。 如何判断种子的质量：pH，培养基中磷，氮，氨基酸含量，菌丝形态，浓度，培养液外观，酶活。,4.2.5 种子质量的控制措施,菌种培养人员的素质和责任心； 菌种观察及选择（菌丝形态整齐，孢子丰满）。 菌种稳定性定期检查的必要性；经常性的摇瓶实验确定其生产性能。 无菌检查。,4.3 培养基灭菌,4.3.1 概述 4.3.2 培养基和设备灭菌 4.3.3 空气除菌,4.3.1 概述,4.3.1.1 灭菌操作的重要性 灭菌是指用化学的或物理学的方法杀灭或除掉物料或设备中所有有生命的有机体的技术或工艺过程。 工业发酵法药物生成多为需氧的纯种发酵过程，因此与生产相关的原材料、设备等均需彻底除菌，这是防止发酵过程染菌、确保正常生产的关键。,4.3.1.2 灭菌方法,火焰灭菌:接种针,玻璃棒,三角瓶口. 干热灭菌:160度,1小时.用于灭菌后需保持干燥的物品.电热法或红外线. 湿热灭菌:培养基等. 射线灭菌:紫外(工作场所),射线(干料). 化学试剂灭菌:工作场所. 高压静电灭菌:空气. 介质过滤除菌:空气.,化学试剂灭菌,0.1-0.25%高锰酸钾:皮肤灭菌; 2-5%漂白粉:用具和车间环境消毒; 75%酒精:皮肤和玻璃器皿表面; 0.25%新洁尔灭溶液:皮肤和玻璃器皿表面;环境消毒. 0.5%甲醛:6-12小时可杀灭所有芽孢细菌,可用于无菌室,摇瓶间,空罐,车间和熏蒸灭菌 5%石炭酸或1%来苏尔:器械或无菌室,车间环境,4.3.2 培养基和设备灭菌,湿热灭菌法： 对培养基和设备的灭菌,以湿热法为佳。效率高,经济实用. 湿蒸汽穿透力强,湿热使蛋白质凝固,使微生物致死. 常用用于培养基的灭菌. 主要参数:灭菌温度，时间和压力. 常用:121度,20-30min. 培养基灭菌过程中，在杀菌的同时，培养基营养成分受破坏。 故应同时兼顾。应选择恰当的灭菌条件。,灭菌方式,空罐灭菌(空消)： 实罐灭菌(实消)：种子罐，发酵罐，计量罐，补料罐等。 间歇或连续灭菌(连消) 管道灭菌等 过滤器除菌 固态培养基的灭菌：蒸煮,（1）加热灭菌原理,微生物的热阻： 加热灭菌原理：热凝固微生物蛋白质。不可逆变性 一般营养细胞，60度，10min（巴氏法），死亡。 细菌芽孢：100度，致死需数分钟至数小时。 嗜热菌，120度，20-30min死亡。 致死温度：杀死微生物的极限温度。 致死时间：在致死温度下，杀死全部微生物所需时间 在致死温度以上，温度越高，致死时间越短。 热阻：微生物在某一条件下的致死时间。,微生物对各种灭菌剂的相对热阻,微生物的热死规律-对数残留定律： 在一定温度下，微生物热死遵循分子反应速度理论，菌的死亡速率-dN/dt与任何一瞬间残存的活菌数成正比。 -dN/dt = KN 故：灭菌时间 t =Log(N0/Nt) 2.303/K K:反应速率常数（1/min),K值越小，微生物越耐热。故杀菌时间t越长。 Nt：微生物残留数。Nt为0的条件是时间无限长。故一般取Nt=0.001。,通常细菌芽孢的K=1（1/min）；枯草芽孢杆菌的K=3.82.6。而营养细胞的K=101000亿。 灭菌要以能杀死细菌芽孢为准。通常计算也不取最耐热的芽孢菌。选用一般耐热的用于计算足矣。 微生物的残留曲线（见下图）： 以灭菌时间为横坐标，以微生物对数残留Log(N0/Nt) （%）为纵坐标，作图，由此图可求得K值。其斜率为-K值。,嗜热芽孢杆菌在不同温度下的残留曲线,微生物杀灭反应速率常数K （1/min),K 值可用Arrhenius方程表示： A：常数（1/min)；T：绝对温度；R：气体常数。 E: 反应所需的活化能（Cal/mol)，活化能可以用于表示一个化学反应发生所需要的最小能量。反应的活化能通常表示为Ea，单位是千焦耳每摩尔。 E越小，K值越大。微生物越不耐热。即被杀灭的速度越快。杀灭的时间就越短。 K表示微生物耐热性，随微生物种类和灭菌温度而异。 相同温度下，K值越小，则微生物愈耐热。同一微生物在不同灭菌温度下，K值不同。 T越高，K值越大；故提高灭菌温度，可使K值增大，灭菌时间则可缩短。,K = Ae E/RT ( min-1),培养基成分破坏速率常数,培养基灭菌同时，培养基成分受破坏。培养基成分受热分解反应和细菌死亡一样都属于一级反应。 也可用反应速率常数表示其受破坏的程度。故培养基成分破坏速率常数k也可用Arrhenius方程表示。,-dC/dt = kC ln (C/C0)= - kt,k1= AeE/RT ( min-1),菌体和营养成分破坏速率常数的关系,温度为T1时，菌体和营养成分的破坏速率常数 温度为T2时，菌体和营养成分的破坏速率常数,速率常数之比： 菌体 营养成分,当灭菌温度由T1提高到T2时。 结论：当温度增高时，菌的死亡速率常数增大的倍数远远大于培养基成分破坏常数增加的倍数。故高温短时灭菌具优越性。,（2）影响培养基灭菌的其它因素,培养基成分：油脂，糖类及一定浓度的蛋白质增加微生物的耐热性。 培养基pH：68之间，微生物最耐热。pH小于6，氢离子易渗入细胞内，pH越低，所需灭菌时间越短。 培养基颗粒度：颗粒越小，越易灭菌。 泡沫：培养基产泡沫对灭菌不利。 对于固态发酵培养基，灭菌难度更大： 颗粒不均；块状；灭菌后的二次污染； 水分含量偏低，热容量小；三相共存，有空隙，热传递阻力大。,（3）培养基灭菌的设计计算,分批灭菌，当温度一定，加热灭菌达到要求所需的时间可由下式求得：,加热时间：t= 1/K(lnN0/Nt) = 2.303/K ( logN0/Nt) 根据： -dN/dt = KN = Ae E/KT N 积分后：杀菌效果：ln（N0/N）=At0 e E/KT dt,K = Ae E/RT ( min-1),t2,t1,t3,在大批量灭菌过程中，加热（升温）和冷却（降温）的时间较长，应考虑其灭菌效果。 升温=ln（N0/N1） =At10 e E/KT dt 维持=ln（N1/N2）=At20 e E/KT dt 降温=ln（N2/N）=At30 e E/KT dt 全部杀菌时间之杀菌效果为：总=加热+加热+冷却 = A（t10e E/KTdt +t20 e E/KT dt + t30 e E/KT dt） 故维持时间t2： t2=1/K(lnN0/N)-At10eE/KTdt-At30eE/KT dt N0，N1，N2，N分别为在灭菌时间0，t1,t1+t2, t1+t2+t3的残留菌数,灭菌计算举例（温度和时间和确定） 间歇灭菌时间的计算(升温到规定温度后的保温时间)： 40m3培养基，121（灭菌速率常数K=1.8min-1），培养液污染程度：2105个耐热细菌芽孢，灭菌失败概率0.001（即每灭菌1000批次，只允许有1个菌残留），求灭菌时间。 培养液中细菌总数N0=401062105=81012个 灭菌后的菌数Nt=0.001个 灭菌时间t =Log(N0/Nt) 2.303/K t=2.303/1.8lg(81012/0.001) =,培养基连续灭菌,优点：可用高温短时间灭菌，营养成分破坏少。 发酵罐利用率高；蒸汽负荷小；可自动控制；劳动强度低。 常用板式热交换器加热。,管道式连续超高温灭菌 物料在连续流动的状态下通过套管式热交换器加热至138150，并在这一温度下保持一定的时间(24秒)以达到无菌水平，,常见的灭菌条件-1,种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管道灭菌条件：从各管道通通入蒸汽，使罐内压力0.147MPa，45min；灭菌时，从各阀门排出空气及蒸汽，尢其对死角要杀菌彻底；关闭蒸汽后，待罐内压力低于空气过滤器压力时，通入无菌空气保压0.098MPa。 发酵罐培养基实罐灭菌条件：从夹层