生化分离技术实践教学大纲.doc

生化分离技术实验教学大纲一、实验教学内容与基本要求实验一 用溶剂萃取法提取与精制红霉素（一）目的要求1掌握溶剂萃取法提取微生物药物的原理和方法。2掌握溶剂萃取法提取微生物药物的步骤和操作要求。（二）实验内容红霉素可在碱性条件下溶于乙酸乙酯有机溶剂中，在酸性条件下溶于水溶液中，在乙酸乙酯相中可成钾盐沉淀析出。（三） 所需实验设施设备1材料 2g红霉素软膏。2器材 量杯、烧杯、布氏漏斗及配套抽滤瓶、培养皿、分液漏斗、铁架及铁圈、玻璃棒、镊子、剪刀、不锈钢扁匙、PH试纸、滤纸及纺绸布、真空烘箱。3试剂乙酸、乙酸乙酯（BA）、饱和食盐水、异丙醇、乙醇-醋酸钾溶液。（四） 教学形式及过程1.讲解实验过程及注意事项，20分钟。2.4人一组，分组实验。实验二 等电点沉析法分离牛乳中的酪蛋白（一）目的要求1学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。2掌握等电点沉析分离的基本操作技术。（二）实验内容蛋白质、酶、氨基酸、核酸等都是两性电解质，当其溶液在某一pH值时，这些生物大分子的所带的正负电荷数目相等而呈电中性，此时溶液的pH值称为该物质的等电点。生物大分子在其等电点的溶液中，溶解度最低，易发生沉淀，一般疏水性较强的蛋白质可用此法分离。（三） 所需实验设施设备1材料 鲜牛奶。2试剂醋酸钠、优级纯醋酸、95%乙醇、乙醚、蒸馏水、0.2mol/L pH 4.7醋酸-醋酸钠缓冲液。3器具烧杯（100 mL、）、玻璃棒、滴管、量筒、离心机、水浴锅、布氏漏斗、精密pH试纸或酸度计、表面皿、电子天平、抽滤瓶。（四） 教学形式及过程1.讲解实验过程及注意事项，30分钟。2.4人一组，分组实验。实验三 离子交换法分离氨基酸（一）目的要求学习用阳离子交换树脂柱分离氨基酸的操作方法和原理。（二）实验内容本实验采用磺酸型阳离子交换树脂分离酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI=2.97，分子量为133.1）和碱性氨基酸赖氨酸（Lys，pI=9.74，分子量为146.2）的混合液。在pH=5.3条件下，因为pH值低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子结合在树脂上；Asp可解离成阴离子，不被树脂吸附而流出层析柱。在pH=12条件下，因pH值高于Lys的pI值，Lys可解离成阴离子从树脂上被交换下来。这样，通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。（三） 所需实验设施设备1材料 磺酸型阳离子交换树脂（732型）2试剂树脂处理液：2mol/LNaOH、2mol/L HCL、1mol/L HCL、1mol/L NaOH、0.45mol/L柠檬酸缓冲液（pH=5.3）、0.01mol/LNaOH缓冲液（pH=12）、天冬氨酸、赖氨酸、茚三酮、无水乙醇。3器具离子交换色谱柱、量筒、吸管、收集器、试管、恒流泵。（四） 教学形式及过程1.讲解实验过程及注意事项，20分钟。2.4人一组，分组实验。实验四 垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质（一）目的要求学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。（二）实验内容蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。（三） 所需实验设施设备1材料 标准蛋白混合液 内含：磷酸化酶(Mw94，000)，牛血清蛋白(Mw67，000)，肌动蛋白(Mw43，000)，磷酸酐酶(Mw30，000)和溶菌酶(Mw14，000)2试剂30凝胶贮备液、分离胶缓冲液(1.5molL)、浓缩胶缓冲液、电极缓冲液(pH8.3)、10SDS、10过硫酸铵(新鲜配制)、1TEMED、上样缓冲液、0.25考马斯亮蓝R-250染色液、脱色液、未知分子量的蛋白质样品3实验器材DYCZ-24D垂直板电泳槽(北京市六一仪器厂)、电泳仪、长滴管及微量加样器、烧杯(250mL、500m1)、量筒(500mL、250m1)、培养皿(15cml5cm)、注射器等。（四） 教学形式及过程1.讲解实验过程及注意事项，20分钟。2.4人一组，分组实验。实验五 乙醇沉析法提取柑橘皮中的果胶（一）目的要求1乙醇沉析法提取柑橘皮中的果胶的基本原理。2掌握有机溶剂沉析法的基本操作技术。（二）实验内容柑橘皮中果胶含量很高，大部分以果胶质形式存在，果胶质不溶于水，但用稀酸可将其水解为可溶性果胶，利用多糖类物质在乙醇中的溶解度的不同，加入一定量乙醇使其沉析，就可使果胶从溶液中析出，经分离、干燥即得果胶纯品。（三） 所需实验设施设备1材料 新鲜柑橘皮50g2试剂正磷酸、O.2molL盐酸、焦磷酸钠（又称磷酸四钠）、80乙醇、95乙醇、硅藻土粉末。3器具组织捣碎机、大烧杯（500mL）、磁力搅拌器、恒温水浴锅、搪瓷桶、酸度计、不锈钢锅、板框压滤机。（四） 教学形式及过程1.讲解实验过程及注意事项，20分钟。2.4人一组，分组实验。实验六 海带中甘露醇的制备及鉴定（一）目的要求1了解甘露醇的理化性质；2掌握从海带中分离提纯甘露醇的原理和基本操作技术。（二）实验内容以海带为原料，用自来水浸泡提取甘露醇；通过调节酸度，沉淀除杂质；煮沸浓缩后用乙醇沉淀甘露醇；最后通过回流、重结晶、活性炭脱色等工艺精制甘露醇。（三） 所需实验设施设备1材料 海藻或海带、粉末活性炭2试剂30NaOH、硫酸-水混合液(1：1)、95乙醇、1molL三氯化铁溶液、1molLNaOH溶液3器具电瓷炉、不锈钢锅、布式漏斗、抽滤瓶、回流装置、pH试纸（四） 教学形式及过程1.讲解实验过程及注意事项，20分钟。2.4人一组，分组实验。二、实验课程学时分配表序号实验项目名称实验学时每组人数实验属性实验类别实验要求内容提要1用溶剂萃取法提取与精制红霉素44专业基础类操作性必做红霉素可在碱性条件下溶于乙酸乙酯有机溶剂中，在酸性条件下溶于水溶液中，在乙酸乙酯相中可成钾盐沉淀析出。2等电点沉析法分离牛乳中的酪蛋白44专业基础类操作性必做牛乳中的酪蛋白是两性电解质，当其溶液在某一pH值，即等电点时，溶解度最低，易发生沉淀，一般疏水性较强的蛋白质可用此法分离。3离子交换法分离氨基酸44专业基础类验证性必做氨基酸是两性电解质，分子上的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的pH值，各种氨基酸分子结构不同，在同一pH值时所带电荷的性质（正、负）和多少不同，与离子交换树脂的亲和力有差异，因此可根据亲和力从小到大的顺序被洗脱液分别洗脱下来，达到分离的效果。4垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质44专业类验证性必做蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。5乙醇沉析法提取柑橘皮中的果胶44专业类综合性必做柑橘皮中果胶含量很高，大部分以果胶质形式存在，果胶质不溶于水，但用稀酸可将其水解为可溶性果胶，利用多糖类物质在乙醇中的溶解度的不同，加入一定量乙醇使其沉析，就可使果胶从溶液中析出，经分离、干燥即得果胶纯品。6海带中甘露醇的制备及鉴定44专业类综合性必做以海带为原料，用自来水浸泡提取甘露醇；通过调节酸度，沉淀除杂质；煮沸浓缩后用乙醇沉淀甘露醇；最后通过回流、重结晶、活性炭脱色等工艺精制甘露醇。三、与其它相关课程的联系与分工本课程实验与有机化学、生物化学等基础课实验具有一定的联系，为专业基础课或专业类实验，让学生具有生产各种生化产品的基本理论和技能，适应不同类型生化工厂及今后从事科学研究工作的需要。四、考核方式本门课程各实验必须完成实验报告，要求实验报告格式规范、列出当次实验的目的、要求、实验内容以及自己的完成情况。实验课成绩占课程总成绩的比例为30%。五、实验指导书、参考书刘叶青. 生物分离工程实验.北京. 高等教育出版社.2007年。张龙翔. 生化实验方法和技术.北京. 高等教育出版社.2006年。生化分离技术实验指导书实验一 用溶剂萃取法提取与精制红霉素实验实验项目名称：用溶剂萃取法提取与精制红霉素实验项目性质：专业基础类所属课程名称： 生物技术原理试验计划学时： 4一、实验的目的通过本实验的学习，使学生了解溶剂萃取法提取微生物药物的原理和方法，掌握溶剂萃取法提取微生物药物的步骤和操作要求。二、实验内容和要求教师讲解实验过程及注意事项后，4人一组，进行操作实验。三、本实验的基本原理和方法红霉素属大环内酯类抗生素，可在碱性条件下溶于乙酸乙酯有机溶剂中，在酸性条件下溶于水溶液中，在乙酸乙酯相中可成钾盐沉淀析出。四、实验主要仪器设备和材料1材料 2g红霉素软膏2器材 量杯、烧杯、布氏漏斗及配套抽滤瓶、培养皿、分液漏斗、铁架及铁圈、玻璃棒、镊子、剪刀、不锈钢扁匙、PH试纸、滤纸及纺绸布、真空烘箱。3试剂乙酸、乙酸乙酯（BA）、饱和食盐水、异丙醇、乙醇-醋酸钾溶液（配制方法：取醋酸钾10g溶于100mL于水乙醇中，配成饱和溶液，现用现配）五、实验方法、步骤（一）取2g红霉素软膏，放入烧杯中，加6ml乙酸丁酯，用乙酸或乙酸丁酯调pH值为 7.2 8.0，抽滤，得澄清滤液，供下一步萃取用。（二）澄清滤液放入搪瓷缸中用乙酸酸化pH值为3.56.0，加乙酸丁酯分两次（每次加1020ml）进行萃取，每次加入后，要在搪瓷缸内上下翻动，使滤液和乙酸丁酯能充分混合接触，然后静置30 min使之分层，用100ml烧杯收集上层萃取液。（三）取上述下相液，加入一定体积的饱和食盐水，加入乙酸乙酯分两次萃取，充分混合接触，待静置分层后，将上层萃取液（BA液）倾倒出或吸出，转入另一只烧杯中。（四）结晶与干燥：量取乙醇-醋酸钾溶液，缓慢加入上述BA液中，待有沉淀产生时，搅拌后静置30min后过滤，得红霉素晶体，将湿晶体放入烧杯中，加异丙醇3050ml，搅拌成糨糊状，然后过滤抽提，将湿品平铺培养皿，可置真空干燥箱干燥得干品。六、实验报告要求认真书写实验报告，做好实验现象的描述、实验结果的分析，要求记录清楚，并对实验方案提出改进的意见等。七、实验中的注意事项1通过调节溶液的pH值使红霉素转入有机溶剂相或水相，应注意控制溶液的pH值。2注意萃取时避免乳化现象。八、思考题1常用的萃取溶剂有哪些？2为何选用饱和食盐水？九、其它说明 无。实验二 等电点沉析法分离牛乳中的酪蛋白实验项目名称：等电点沉析法分离牛乳中的酪蛋白实验项目性质：专业基础类所属课程名称： 生物技术原理试验计划学时： 4一、实验的目的通过本实验的学习，使学生了解从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法，掌握等电点沉析分离的基本操作技术。二、实验内容和要求教师讲解实验过程及注意事项后，4人一组，进行操作实验。三、本实验的基本原理和方法蛋白质、酶、氨基酸、核酸等都是两性电解质，当其溶液在某一pH值时，这些生物大分子的所带的正负电荷数目相等而呈电中性，此时溶液的pH值称为该物质的等电点。生物大分子在其等电点的溶液中，溶解度最低，易发生沉淀，一般疏水性较强的蛋白质可用此法分离。四、实验主要仪器设备和材料1材料 鲜牛奶2试剂醋酸钠、优级纯醋酸、95%乙醇、乙醚、蒸馏水、0.2mol/L pH 4.7醋酸-醋酸钠缓冲液其配制如下：配A液：0.2mol/L醋酸钠溶液，称NaAcH2O 5.44g溶至200mL。配B液：0.2mol/L醋酸溶液，称优级纯醋酸2.4g溶至200mL。取A液约17.7mL，B液约12.3mL混合，用酸度计调得pH 4.7醋酸-醋酸钠缓冲液30mL。3器具烧杯（100 mL、）、玻璃棒、滴管、量筒、离心机、水浴锅、布氏漏斗、精密pH试纸或酸度计、表面皿、电子天平、抽滤瓶五、实验方法、步骤1.将鲜牛奶30 ml及醋酸-醋酸钠缓冲液30ml分别水浴加热40左右。并用8层纱布过滤牛奶。2.量取加热后的牛奶20ml。在搅拌下慢慢加入加热后的醋酸-醋酸钠缓冲液20ml。用酸度计调pH至4.7。3.将上述混合液冷至室温，离心（3500r/min）15min，弃去上清液，得酪蛋白粗制品。4.用水洗沉淀3次，离心（3500r/min）10min，弃去上清液5.在沉淀中加入20ml乙醇，搅拌片刻。将全部的悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇-乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。6.将沉淀摊开在表面皿上，风干得酪蛋白纯品。7.准确称量，计算含量和收率。含量=酪蛋白g/100mL牛乳测得含量理论含量收率=100%式中理论含量为3.5g/100mL牛乳。 六、实验报告要求认真书写实验报告，做好实验现象的描述、实验结果的分析，要求记录清楚，并对实验方案提出改进的意见等。七、实验中的注意事项1醋酸-醋酸钠缓冲液的配制应规范，pH值应用酸度计测试，以准确达到酪蛋白的等电点。2.加入醋酸-醋酸钠缓冲液时，动作要缓慢，并慢慢加入，不可操之过急而大量一次加入。3.离心前温度一定要降至室温。八、思考题1为何用醋酸-醋酸钠缓冲液来调酪蛋白的等电点，可否改用酸或碱来？2如何提高酪蛋白的收率？九、其它说明 无。实验三 离子交换法分离氨基酸实验项目名称：离子交换法分离氨基酸实验项目性质：专业基础类所属课程名称： 生物技术原理试验计划学时： 4一、实验的目的通过本实验的学习，使学生了解离子交换树脂分离氨基酸基本原理，掌握阳离子交换树脂处理技能和分离氨基酸的操作步骤。二、实验内容和要求教师讲解实验过程及注意事项后，4人一组，进行操作实验。三、本实验的基本原理和方法有些高分子物质含有一些可以解离的基团，因此可以和溶液中的离子产生交换反应。这类高分子物质统称离子交换剂，其中使用的最普遍的是离子交换树脂。由于一定离子交换剂对于不同离子的静电引力不同，因此在洗脱过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后完全分离。本实验采用磺酸型阳离子交换树脂分离酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI=2.97，分子量为133.1）和碱性氨基酸赖氨酸（Lys，pI=9.74，分子量为146.2）的混合液。在pH=5.3条件下，因为pH值低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子结合在树脂上；Asp可解离成阴离子，不被树脂吸附而流出层析柱。在pH=12条件下，因pH值高于Lys的pI值，Lys可解离成阴离子从树脂上被交换下来。这样，通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。四、实验主要仪器设备和材料1材料 磺酸型阳离子交换树脂（732型）2试剂树脂处理液：2mol/LNaOH、2mol/L HCL、1mol/L HCL、1mol/L NaOH、0.45mol/L柠檬酸缓冲液（pH=5.3）、0.01mol/LNaOH缓冲液（pH=12）、天冬氨酸、赖氨酸、茚三酮、无水乙醇。3器具离子交换色谱柱、量筒、吸管、收集器、试管、恒流泵。五、实验方法、步骤（一）新树脂的处理和转型1干树脂用蒸馏水充分浸泡膨胀后，倾去细小颗粒，然后用4倍体积的2mol/L HCL和2mol/L NaOH依次浸洗搅拌30min，并分别用蒸馏水洗至中性（最后应处理至溶液无黄色）。2再用1mol/L NaOH浸泡510 min，使树脂转为钠型。以蒸馏水洗去NaOH至树脂pH呈中性（大约洗23次）。（二）装柱前准备用蒸馏水冲洗层析柱，将层析柱垂直装好，在柱流水出口处装上乳胶管，关闭柱底出口（或使用调控阀），在柱内加入23cm高的柠檬酸缓冲液，排出乳胶管内气泡，抬高乳胶管出口，防止柱内缓冲液排空。（三）装柱将处理好的树脂放入烧杯中，加入1倍2倍体积的柠檬酸缓冲液并搅拌成悬浮状，沿柱内壁缓慢流入装柱，待树脂自然下沉在柱底部逐渐沉积23cm高时，慢慢打开柱底出口，再继续加入树脂悬液直至树脂沉积高度为1618cm时为止。装柱要求连续、均匀，无分层、无气泡等现象产生，必须防止液面低于树脂平面，否则要重新装柱。（四）平衡层析柱装好后，再缓慢沿管壁加满柠檬酸缓冲液，接上恒流泵，用柠檬酸缓冲液以5滴/min流速平衡40min左右，直至用pH试纸测得流出液的pH与缓冲液的pH相等为止。（五）加样与洗脱1移去层析柱上连接泵的橡胶管，打开柱底出口，小心使柱内缓冲液的液面与树脂平面几乎相平时即行关闭（注意：不要是树脂露出液面）。马上用加样器吸取氨基酸混合样品0.5ml，沿靠近树脂表面的管壁慢慢加入（注意不要破坏树脂平面），然后缓慢打开柱底管夹，使液面再与树脂面相齐时关闭。2然后加少量柠檬酸缓冲液清洗内壁23次，使样品进入柱内。当样品完全进入树脂床内，即可接上恒流泵，调流速0.5ml/min，开始洗脱。（六）收集柱洗脱液可用自动分部收集器或以刻度试管人工收集，按每管3ml先收集5管。（七）改用pH=12 NaOH缓冲液洗脱收集关闭恒流泵和柱底夹，将洗脱液更换为pH=12 NaOH缓冲液，然后按上面同样方法继续收集第6管到第10管。（八）测定将收集的洗脱液各管编好号后，分别取0.5ml收集于一洁净的试管中，加入柠檬酸缓冲液（pH=5.3）1ml，茚三酮显色液0.5ml，混合后置沸水水浴加热15min，取出，用冷水冷却。六、实验报告要求认真书写实验报告，做好实验现象的描述、实验结果的分析，要求记录清楚，并对实验方案提出改进的意见等。七、实验中的注意事项1.为使分离色带整齐，装柱时层析柱一定要无裂缝和气泡。2.分离洗脱过程中，要连续不断加入洗脱液，并保持一定高度的液面，在整个操作中绝不能使树脂表面的液体流干。3.一直保持流速10滴/min12滴/ min，并注意勿使树脂表面干燥。八、思考题1离子交换树脂用缓冲液平衡，为什么又用缓冲液冲洗？2何谓氨基酸的离子交换？本实验采用的离子交换剂属于哪一种？九、其它说明 无。实验三 垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质实验项目名称：垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质实验项目性质：专业类所属课程名称： 生物技术原理试验计划学时： 4一、实验的目的通过本实验的学习，使学生学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)测定蛋白质的分子量的原理，掌握电泳的基本操作技术。二、实验内容和要求教师讲解实验过程及注意事项后，4人一组，进行操作实验。三、本实验的基本原理和方法蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动；蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等。聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。本实验采用不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带。这就是常说的浓缩效应和分子筛效应。同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7-6.8，下层胶pH8.9；Tris-HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离子的解离度，进而达到控制其有效迁移率之目的。不同蛋白质具有不同的等电点，在进入分离胶后，各种蛋白质由于所带的静电荷不同，而有不同的迁移率。由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分子筛效应及电荷效应，使不同的蛋白质在同一电场中达到有效的分离。如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质-SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异。蛋白质分子量愈小，在电场中移动得愈快；反之，愈慢。蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是：Mr=K(10-bm)logMr=LogK-bRm，式中Mr-蛋白质的分子量；logK-截距；b-斜率；Rm-相对迁移率。实验证明，蛋白质分子量在15，000-200，000的范围内，电泳迁移率与分子量的对数之间呈线性关系。蛋白质的相对迁移率Rm蛋白质样品的迁移距离染料(溴酚蓝)迁移距离。这样，在同一电场中进行电泳，把标准蛋白质的相对迁移率与相应的蛋白质分子量对数作图，由未知蛋白的相对迁移率可从标准曲线上求出它的分子量。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法测定蛋白质的分子量具有简便、快速、重复性好的优点，是目前一般实验室常用的测定蛋白质分子量的方法。四、实验主要仪器设备和材料1材料 标准蛋白混合液 内含：磷酸化酶(Mw94，000)，牛血清蛋白(Mw67，000)，肌动蛋白(Mw43，000)，磷酸酐酶(Mw30，000)和溶菌酶(Mw14，000)2试剂1)标准蛋白混合液内含：磷酸化酶(Mw94，000)，牛血清蛋白(Mw67，000)，肌动蛋白(Mw43，000)，磷酸酐酶(Mw30，000)和溶菌酶(Mw14，000)2)30凝胶贮备液：Acr30g，Bis0.8g，加蒸馏水至100mL3)分离胶缓冲液(1.5molL):Tris18.15g，加水溶解，6mol/LHCl调pH8.9，定容100mL4)浓缩胶缓冲液(0.5molL):Tris6g，加水溶解，6mol/LHCl调pH6.8，并定容到100mL5)电极缓冲液(pH8.3)：SDSlg，Tris6g，Gly28.8g，加水溶解并定容到1000mL。用时稀释五倍。6)10SDS7)10过硫酸铵(新鲜配制)8)1TEMED9)上样缓冲液：0.5molLTris-HClpH6.81.25mL，50甘油4mL，10SDS2mL，巯基乙醇0.4mL，0.1溴酚蓝0.4mL，加蒸馏水定溶至10mL。10)0.25考马斯亮蓝R-250染色液：考马斯亮蓝R-2501.25g，50甲醇454mL，冰乙酸46mL。11)脱色液：冰乙酸35mL，蒸馏水465mL。12)未知分子量的蛋白质样品(1mgmL)3实验器材DYCZ-24D垂直板电泳槽(北京市六一仪器厂)、电泳仪、长滴管及微量加样器、烧杯(250mL、500m1)、量筒(500mL、250m1)、培养皿(15cml5cm)、注射器等五、实验方法、步骤1装板将密封用硅胶框放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠，将两块玻璃立起来使底端接触桌面，用手将两块玻璃夹住放入电泳槽内，然后插入斜插板到适中程度，即可灌胶。2凝胶的聚合分离胶和浓缩胶的制备：按下表中溶液的顺序及比例，配置10的分离胶和4.8的浓缩胶。试剂名称10%的分离胶/mL4.8%的浓缩胶/mLAcr/Bis30%分离胶缓冲液（pH8.9）浓缩胶缓冲液（pH6.8）10%SDS10%过硫酸铵水TEMED53.7500.150.1511.601.250.10.14.951按上表各液加入混匀后配制成分离胶后，将凝胶液沿凝胶腔的长玻璃板的内面缓缓用滴管滴入，小心不要产生气泡。将胶液加到距短玻璃板上沿2cm处为止，约5mL。然后用细滴管或注射器仔细注入少量水，约0.5-1mL。室温放置聚合30-40min。待分离胶聚合后，用滤纸条轻轻吸去分离胶表面的水分，按上表制备浓缩胶。用长滴管小心加到分离胶的上面，插入样品模子(梳子)；待浓缩胶聚合后，小心拔出样品模子。3蛋白质样品的处理若标准蛋白质或欲分离的蛋白质样品是固体，称取lmg的样品溶解于lmL0.5molLpH6.8Tris-盐酸缓冲液或蒸馏水中；若样品是液体，要测定蛋白质浓度，按1.01.5mgmL溶液比例，取蛋白质样液与样品处理液等体积混匀。本实验所用样品为1520mg的标准蛋白样品溶液，放置在0.5mL的离心管中，加入15-20ml的样品处理液。在100水浴中处理2min，冷却至室温后备用。吸取未知分子量的蛋白质样品20ml，按照标准蛋白的处理方法进行处理。4加样SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板型电泳的加样方法：用手夹住两块玻璃板，上提斜插板使其松开，然后取下玻璃胶室去掉密封用硅胶框，注意在上述过程中手始终给玻璃胶室一个夹紧力，再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽，插入斜板，将缓冲液加至内槽玻璃凹面以上，外槽缓冲液加到距平板玻璃上沿3mm处即可，注意避免在电泳槽内出现气泡。加样时可用加样器斜靠在提手边缘的凹槽内，以准确定位加样位置，或用微量注射器依次在各样品槽内加样，各加1015ml(含蛋白质1015mg)，稀溶液可加2030ml(还要根据胶的厚度灵活掌握)。5电泳加样完毕，盖好上盖，连接电泳仪，打开电泳仪开关后，样品进胶前电流控制在1520mA，大约1520min；样品中的溴酚蓝指示剂到达分离胶之后，电流升到3045mA，电泳过程保持电流稳定。当溴酚蓝指示剂迁移到距前沿12cm处即停止电泳，约1-2小时。如室温高，打开电泳槽循环水，降低电泳温度。6染色、脱色电泳结束后，关掉电源，取出玻璃板，在长短两块玻璃板下角空隙内，用刀轻轻撬动，即将胶面与一块玻璃板分开，然后轻轻将胶片托起，指示剂区带中心插入铜丝作为标志，放入大培养皿中染色，使用0.25的考马斯亮蓝染液，染色24h，必要时可过夜。弃去染色液，用蒸馏水把胶面漂洗几次，然后加入脱色液，进行扩散脱色，经常换脱色液，直至蛋白质带清晰为止。7结果处理1)测量脱色后凝胶板的长度和每个蛋白质样品移动距离(即蛋白质带中心到加样孔的距离)，测量指示染料迁移的距离。2)按以下公式计算蛋白质样品的相对迁移率(Rm)相对迁移率样品迁移距离(cm)染料迁移距离(cm)3)标准曲线的制作：以各标准蛋白质相对迁移率为横坐标，蛋白质分子量的对数为纵坐标在半对数坐标纸上做图，得到一条标准曲线。4)测定蛋白质样品的分子量：根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查得该蛋白质的分子量。六、实验报告要求认真书写实验报告，做好实验现象的描述、实验结果的分析，要求记录清楚，并对实验方案提出改进的意见等。七、实验中的注意事项1Acr和Bis有神经毒性，可经皮肤、呼吸道等吸收，故操作时要注意保护。2.固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板.凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED（四甲基乙二胺）要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡.3.注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散。为避免边缘效应,最好选用中部的孔注样.八、思考题1聚丙烯酰胺盘状凝胶电泳的几个不连续性是什么？2电泳后上下槽缓冲液可否混合后再使用？为什么？3上样缓冲液中加入甘油的作用是什么？4贮液配制及贮存应注意什么？5过硫酸铵、7%乙酸和考马斯亮蓝在实验中有什么作用？九、其它说明 无。实验五 乙醇沉析法提取柑橘皮中的果胶实验项目名称：乙醇沉析法提取柑橘皮中的果胶实验项目性质：专业类所属课程名称： 生物技术原理试验计划学时： 4一、实验的目的通过本实验的学习，使学生了解乙醇沉析法提取柑橘皮中的果胶的基本原理，掌握有机溶剂沉析法的基本操作技术。二、实验内容和要求教师讲解实验过程及注意事项后，4人一组，进行操作实验。三、本实验的基本原理和方法果胶是植物胶，属于多糖类，存在于高等植物的叶、茎、根的细胞壁内，与细胞彼此粘合在一起，尤其是果实及叶的含量较多；也是一种亲水的植物胶，能溶于20倍水中生成粘稠溶液，不溶于乙醇及一般有机溶剂，在酸性条件下稳定。由于其水溶液在适当的条件下可以形成凝胶，具有良好的胶凝化和乳化作用，因此可用于制造果酱、果冻或胶状食物，也可用作食品添加剂、微生物培养基及保护剂等。果胶因其酯化度不同，可分为高酯果胶和低酯果胶。采用的原料和提取方法不同可得到不同酯化度的果胶。以柑橘皮为原料生产的为高酯果胶（向日葵果胶其酯化度为30，是低酯果胶）。柑橘皮中果胶含量很高，一般为515左右。大部分以果胶质形式存在，果胶质不溶于水，但用稀酸可将其水解为可溶性果胶，利用多糖类物质在乙醇中的溶解度的不同，加入一定量乙醇使其沉析，就可使果胶从溶液中析出，经分离、干燥即得果胶纯品。四、实验主要仪器设备和材料1材料 新鲜柑橘皮50g2试剂 正磷酸、O.2molL盐酸、焦磷酸钠（又称磷酸四钠）、80乙醇、95乙醇、硅藻土粉末。3器具组织捣碎机、大烧杯（500mL）、磁力搅拌器、恒温水浴锅、搪瓷桶、酸度计、不锈钢锅、板框压滤机。五、实验方法、步骤1预处理 将柑橘皮在组织捣碎机中捣碎置于不锈钢锅中，加入45倍的清水搅拌，加热到5060浸泡10min，加热至沸水中浸5min8min，以达到灭酶目的。灭酶后的柑橘皮在不断搅动下用流动水冲洗至洗液接近无色为止。2提取 取处理好的柑橘皮置于搪瓷桶中，加入15倍量的自来水，再加入水量0.5的焦磷酸钠。在不断搅拌的条件下，用盐酸和0.5磷酸的混合酸调节提取液的pH值，温度控制在7582，调节提取液pH值至1.52.0时继续搅拌提取20min，然后再调节pH值至2.5，继续再提取20min。3分离 将提取液加入1的硅藻土作助滤剂，然后送入板框压滤机。过滤后得无色透明的果胶稀溶液，滤渣弃去。4浓缩 将过滤收集的滤液置于真空浓缩装置中，于75温度下浓缩，直至浓缩到果胶浓度为4左右。5沉析 将浓缩液置于搪瓷桶中，并冷至室温，然后乙醇以喷淋方式加至已浓缩好的果胶溶液中，乙醇含量控制在4050的范围内，不断搅动。这时，果胶聚结成海绵状析出。6分离 将果胶乙醇混合物经12h静置后，送入板框压滤机过滤。收集滤饼(果胶)，然后用80乙醇溶液洗涤滤饼12次，再用95的乙醇洗涤12次。洗完后压干。7干燥 将以上滤好的果胶置于真空干燥器中于55左右干燥，即得果胶纯品。六、实验报告要求认真书写实验报告，做好实验现象的描述、实验结果的分析，要求记录清楚，并对实验方案提出改进的意见等。七、实验中的注意事项1提取温度 温度过高容易引起果胶解聚，降低果胶胶凝能力。温度过低，则会延长萃取时间，造成果胶过分脱脂，一般以7582为宜。2提取时间 时间短，提取不完全；时间过长，则会引起果胶降解，难以得到高质量的果胶。提取时间以40min60min为宜。3提取的pH值 pH值高，获得果胶的胶凝能力强，但果胶收率低，当pH值大于3.5时，就很难得到果胶。pH值低，果胶收率提高，但质量下降。在提取过程中，体系的pH值会发生变化，要经常用试纸检测溶液的pH值，要使之保持稳定，以保证提取正常进行。4脱色及醇洗 灭酶后的柑橘皮水洗脱色及进行分离操作时助滤剂的使用都有一定的脱色作用。脱色处理要彻底及最后的高浓度乙醇洗涤果胶滤饼时要充分，否则影响所得果胶纯品色泽及含量。八、思考题1柑橘皮预处理时为何要加热至沸而灭酶？2如何提