菌种与种子扩大培养.ppt

第一章 菌种与种子扩大培养 重点：微生物工业对菌种的要求；生产用菌 种的保藏及选育；防止菌种衰退的措施 难点：工业微生物的培养类型,第一节 微生物工业用菌种 一、微生物工业对菌种的要求 培养基原料来源广、廉价； 培养条件易控制； 对于微生物的生长往往存在一个“临界溶氧浓度”，低于这个溶氧浓度，氧就成了微生物生长的限制性因子。 pH值:中性偏酸性，偏碱性，强烈的pH值易改变产物和底物的状态。 温度：最低、最高、最适生长温度，低温菌，耐高温菌种。 渗透压：等渗,发酵周期短； 菌株高产；对于胞外产品，细胞膜具有良好的渗透性，或者细胞膜的渗透性可以调节，细胞不易发生菌体自溶。 对于胞内产品，要求菌体易分离和收集，菌体易破碎； 对于基因工程菌，通常目的产物存在于包含体内，对于包含体，要求在细胞破碎时不易破碎，而在目的产物的分离提取时，则易破碎。 抗病毒（噬菌体）能力强； 菌株性状稳定，不易变异退化； 菌体本身不能是病原菌； 二、工业常用的微生物,从微生物分类学的角度，分为：,细菌类： 短杆菌：氨基酸发酵（谷氨酸） 枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白 酶等 地衣芽孢杆菌：耐高温-淀粉酶) 苏云金芽孢杆菌：BT生物农药 梭状芽孢杆菌：丙酮、丁酸等发酵 酵母菌： 啤酒酵母：酿酒酵母、辅酶类物质的发酵 酒精酵母：酒精 汉逊酵母：食品工业，用于乙酸乙酯的发酵 假丝酵母：scp生产，石油发酵,霉菌： 黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业、 酶制剂工业（糖化酶） 黄曲霉：酱油生产(3042)，面酱 青霉菌：青霉素的生产 红曲霉：红曲制造，用于南方红曲酒 （女儿红）的生产；使用红色色 素的生产；豆腐乳的生产等 赤霉菌：赤霉素的生产，是一种植物生 长激素,工业常用的微生物：细菌,工业常用的微生物：放线菌,工业常用的微生物：霉菌,三、生产菌种的保藏与选育 菌种保藏 （1）目的： 存活，不丢失，不污染； 防止优良性状丢失； 随时为生产、科研提供优良菌种。 （2）基本原理：根据菌种的生理生化特点，人工地创造 条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态。 （3）常用的菌种保藏方法： 斜面低温保藏法、甘油低温保藏法、砂土保藏法、麸皮保藏法、冷冻干燥法、液氮超低温冻结法等。,几种常用菌种保藏方法的比较,划线培养后的细菌菌落,酿酒酵母,霉菌孢子,国内外菌种保藏机构： 菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、 菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、 不乱以及便于研究、交换和使用的目的。 菌种保藏机构： 中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL） 工业微生物 / 农业微生物 /,四、菌种选育 （1）目的：改善菌种的特性，使提高产量，改进质量，降低成本，改革工艺，方便管理及综合利用等。 （2）方法：A、自然选育；B、抗噬菌体菌株选育；C、诱变育种；D、代谢控制育种；E、基因重组育种； 五、防止菌株衰退的措施 1、菌种退化：多次传代，发酵力、繁殖力下降；发酵产物得率低。 2、衰退的可能原因 菌种保藏不妥； 培养要求未得到满足；,3.防止菌种衰退的方法 尽可能满足其营养条件、培养条件，避免有害因素 影响； 尽量减少传代次数； 采用幼龄菌种； 4.菌种复壮方法 分离复壮（稀释平板法、平板划线法等）； 若单菌落分离不行，可改变培养条件，或两者结合进行复壮； 诱变因素处理，再进行单菌落分离；,第二节 种子扩大培养 一、种子扩大培养的任务 1.任务：每次发酵罐的投料，要提供相当数量代谢旺盛的种子。根据菌种生长速度快慢来决定扩大培养的级数； 2、三级发酵（50吨发酵罐）： 斜面一级摇床二级种子罐三级种子罐发酵罐 二、工业微生物的培养类型 静置培养法（厌气性发酵）；少，如酒精发酵 通气培养法（好气性发酵）；主要，如抗生素等 通气培养法作为种子扩大培养的具体方法： 液体培养法：三角瓶摇床震荡或回转式培养； 表面法培养：液体表层，菌体生长于表面；,固态法培养：固体培养基表面生长 大规模工业生产的培养方法及特点： 固体培养（曲法培养） 浅盘固体培养 深层固体培养 特点：酶活力高，但劳动强度大，曲层需翻动。 液体培养 浅盘液体培养：已不用，占地面积大 液体深层培养：几乎所有的好气培养都采用 特点：培养条件易控制，如温度，pH等，但易染菌，要求无菌。,载体培养： 吸收了固态的曲法培养与液态培 养的优点，是近年新发展的一种培养方法。 特点：固态基质做载体，发酵结束后将培养基及菌体挤压出来，载体可反复使用，如脲烷泡沫塑料块。 两步法液体深层培养：在酶制剂和氨基酸生产中应用较多。 特点：控制菌体生长条件与产酶条件区分开来，如先菌体生长，再改变条件产酶。,三、影响种子质量的主要因素 1.培养基 主要是碳源、氮源、无机盐、生长素和水等。 选用原则：组分简单，来源丰富，价格便宜，取材方便等。 对于种子用的培养基，摇瓶与种子罐用的培养基不相同，摇瓶要求培养基用的原材料精细，碳源浓度较低而且是用微生物较易利用的碳源；对于种子罐用培养基，要求使用接近大生产用的原材料，氮源浓度较高，有利于菌体的增殖。例如：HASS（高温淀粉酶） 三角瓶用碳源：葡萄糖+乳糖 3m3种子罐：液化淀粉,2、种龄与接种量：,种龄以对数期为宜； 接种量宜适当大； 接种量大的优缺点： 优点：缩短发酵周期； 减少染菌机会； 提高设备利用率 缺点：种子培养费时； 增加级数； 代谢废物多,3.培养条件 温度：温度直接影响生长和酶的合成； 种子扩大培养的温度，从试管到三角瓶到种子罐，其温度也应逐步调整，最后接近大生产的温度，目的在于使菌种逐渐适应。 许多微生物其最适生长温度与最适发酵温度往往有差异的，例如：谷氨酸发酵，谷氨酸产生菌的最适合生长温度为：30，而产物合成温度为32-34 pH值：对微生物有明显的影响。 1）扩培选择的pH值是菌体的最适生长pH值。 2）培养基灭菌后，通常其pH值要下降0.51.0个单位,通气搅拌：（溶解氧的作用：参与菌体呼吸 作用）菌种扩大培养的目的就是提供大量的强壮的菌体，因此在扩培过程要求菌体增殖速度越快越好，增殖期消耗的底物葡萄糖越少越好，从这个意义上讲，扩培过程中应提供足够的氧气。 足够的溶氧取决于：搅拌转速、通气量、搅拌功率等 泡沫(危害：影响微生物对氧的吸收；妨碍CO2的排除；减少设备利用率) 消泡方法：化学法（为主）、机械法 常用消泡剂：植物油，矿物油等,3.染菌的控制 染菌原因：设备、管道、阀门漏损、发酵罐结构“死角”、灭菌不彻底、空气净化不好、无菌操作不严、菌种不纯； 4.种子罐级数：级数少则简单 种子罐级数的选择取决于： 种子的性质（生长繁殖性能）； 孢子瓶中孢子的密度（密度大则级数少）； 孢子发芽及菌丝繁殖速度； 发酵罐中种子的最低接种量（一般10%）