实验九、十酶联免疫吸附试验.ppt

实验九 酶联免疫吸附试验-ELISA 实验十 IgG的分离和纯化,程 燕 2014年6月9日,实验九 酶联免疫吸附试 （ Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）,实验目的,1.掌握酶联免疫吸附试验的原理、种类和用途。 2.学习用酶联免疫吸附试验双抗体夹心法检测乙型肝炎表面抗原（HBsAg）的方法。 3.了解HBsAg阳性的意义。,实验原理,用酶来标记抗原或抗体的免疫分析分析技术。由于酶的高效生物催化作用，产生了放大作用，使得原来极其微乎其微的抗原或抗体在数分钟后就可被识别出来，这种技术被称为酶联免疫吸附试验法。,实验原理,将已知抗体（或抗原）结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。 测定时将待检标本和酶标抗体（或酶标抗原）按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体（或抗原）发生反应，用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离物成分，然后加入底物显色，进行定性或定量测定。,实验原理,ELISA的基本原理有三条： （1）抗原或抗体能以物理性（疏水性）地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性； （2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； （3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。,实验原理,常用酶联免疫吸附试验有 间接法 竞争法 双抗体夹心法,ELISA-间接法,此法是检测抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体上，加入待测血清(抗体)与之结合，洗涤后，加酶标抗体和底物进行测定。其原理见图。,底物,用于抗原及半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。 以测定抗原为例，将特异性抗体吸附于固相载体上，加入待测抗原和一定量的已知酶标抗原，使二者竞争地与固相抗体结合，经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。,ELISA-竞争法,ELISA-双抗体夹心法,双抗体夹心法常用于检测抗原。 将已知抗体吸附于固相载体，加入待测标本(含相应抗原)与之结合，温育后洗涤，加入酶标抗体及底物溶液进行测定。,实验材料,1、乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒 定性检测人血清或血浆中的乙型肝炎病毒表面抗原HBsAg。 包括： HBsAg特异性抗体（一抗）已包被于酶标板上 HBsAg阴、阳性血清各1份、 酶标抗体（二抗）1份， 显色剂A、B各1份，终止液1份，洗涤液1份， 2、待检血清5份 3、微量加样器（10-100ul）及匹配的枪头 4、废液缸 注意：有污染性。,夹心法检测HBsAg方法,由于抗体1已包被在酶标板上，故直接从加抗原开始。 1、加样：每组2条8孔，待检8孔，阴性对照、阳性对照、空白对照各1孔。分别加75ul待测样本和阴、阳性对照于相应孔内，盖封板膜，置37恒温箱温育60分钟。 2、加酶标抗体： 除空白对照孔外，每孔加1滴酶标溶液，混匀后封板， 置37水浴箱温育30分钟。 3、洗涤： 用洗涤液（按说明配制）注满各孔，静置20秒，甩去洗涤液，重复4次，最后一次在吸水纸上拍干。 4、显色： 每孔加底物液A 、B 各1滴（50ul），轻拍混匀，置37避光显色30分钟，肉眼观察。 5、终止：每孔加终止液1滴（50ul），轻拍混匀。在10分钟内酶标 6、测定：用酶标仪（波长450nm）测定各孔吸光度OD值。,酶：辣根过氧化物酶(HRP) 底物：3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB） 在辣根过氧化物酶催化下，TMB会产生可溶性蓝色产物。使用2M H2SO4终止反应，在 450nm测定吸光度。,结果判断,1、定性：夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。 2、P/N值2.1者判为HBsAg阳性；P/N值2.1者判为阴性。介于中间为可疑。 S：待测样本OD值 COV： cut-off value =NCx+0.100 NCx：阴性对照OD值的均值 阳性判定值=S/COV 1.0：阳性 1.0：阴性,实验报告,1、计算5个待测样本的S/COV，判断结果 2、本实验中采用的酶、底物及反应原理。,实验十 IgG的分离和纯化,实验目的,实践IgG分离纯化过程 了解分离、纯化抗体的原理 比较成年牛血清与新生牛血清中IgG的含量（眼观）,实验原理,利用蛋白质盐析原理，分离血清中的IgG: 不同蛋白质在同一浓度盐溶液中的溶解度不同，因此，可利用不同浓度的盐溶液使血清中的各个蛋白质成分分别析出。,血清蛋白质：复杂混合物。 1、白蛋白、a1、a2、球蛋白，纤维蛋白原，凝血酶原和其它凝血因子等均由肝细胞合成。 2、球蛋白主要来自浆细胞。 免疫球蛋白大多数存在于丙种球蛋白（-球蛋白）中。 免疫球蛋白可以分为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五类。,一般pH7.0时，50硫酸铵饱和度可将所有的5种Ig（球蛋白）沉淀出来。33饱和度大部分IgG可沉淀出来。 意义：制备出的纯化IgG，可用于酶标抗体或荧光抗体的制备。,实验器材,1动物抗血清：成年牛血清、新生牛血清 2硫酸铵饱和溶液、0.01mol/L的PBS 3冰箱、离心机、电磁搅拌器、天平、尼龙绳等。,实验步骤,1.取xml血清（2ml），加等量0.01mol/L的PBS稀释，搅拌下逐滴加入饱和(NH4)2SO4溶液2X ml（4ml），边加边搅拌，4静置30分钟以上，使其充分沉淀。 2.离心：30004000r/min离心20min，弃上清。 3.以0.01mol/L的PBS溶解沉淀至Xml（5ml），再逐滴加入饱和(NH4)2SO4 X/2ml（2.5ml)。置4，3060分钟。 4.再离心：3000r4000r/min离心20min，弃上清。 5.重复上