乙型肝炎病毒大蛋白检测及其临床意义.doc

乙型肝炎病毒大蛋白检测及其临床意义 乙型肝炎病毒（HBV，hepatitis B virus）大蛋白存在于感染性颗粒（Dane颗粒）和亚病毒管状颗粒上，是病毒形成完整外膜的重要标志，与病毒复制密切相关，具有反式激活作用，并与病毒颗粒从细胞内释放有关1。有研究表明HBV 大蛋白具有双重跨膜拓扑结构2，针对HBV大蛋白特殊构象制备的单克隆抗体，可以更准确地检测血清中乙肝病毒外膜大蛋白。为了解乙肝患者血清中HBV大蛋白与HBV DNA的相关性，我们对179例HBV感染者血清HBV大蛋白进行了检测。 1材料与方法 1.1 研究对象179例病例为本院2008年6月-2009年11月住院患者，男性122例，女性57例，年龄17-65岁，平均年龄为3612.5岁，诊断标准符合2000年中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学分会联合修订的“病毒性肝炎防治方案”中病毒性肝炎诊断标准。 1.2标本来源血液标本由真空采血管采集、分离血清后冻存于-20保存。 1.3主要试剂HBV DNA检测采用广州中山大学达安基因股份有限公司试剂；HBV“二对半”检测采用时间分辨荧光免疫分析法，试剂购置苏州新波生物技术有限公司；HBV大蛋白定量检测试剂由北京热景生物技术有限公司提供。 1.4主要方法HBV-LP检测试剂应用结构生物学和免疫学技术，筛选出针对乙型肝炎病毒大蛋白前S区立体构象型表位的高特异性、高亲和力的单克隆抗体，并在微孔条上预包被，配以辣根过氧化物酶标记抗体，TMB显色，采用双抗体夹心法原理检测。 1.5统计学处理采用SPSS13.0软件进行统计分析，HBV-LP和HBV DNA阳性检出率比较采用配对计数资料x2检验。 2结果 2.1HBV DNA与LP阳性率比较179例HBV感染者血清同步检测HBV DNA和HBV LP，HBV DNA（+）144例（80.4%），HBV LP（+）145例(81.0%)，其中HBV DNA（+）、HBV LP（+）126例，HBV DNA（+）、HBV LP（-）18例，HBV DNA（-）、HBV LP（+）19例，HBV DNA（-）、HBV LP（-）16例，以HBV DNA和HBV LP作为判断病毒复制的指标，差异无统计学意义 (x2=0.01,P>0.05)。 2.2 HBV LP与HBeAg阳性率的比较 144例HBV DNA阳性患者中，HBV LP（+）126例（87.5%），HBeAg（+）73例（50.7%）,其中HBV LP（+）、HBeAg（+）65例，HBV LP（+）、HBeAg（-）61例，HBV LP（-）、HBeAg（+）8例，HBV LP（-）、HBeAg（-）10例，以HBV DNA和HBeAg作为判断病毒复制的指标，差异有统计学意义（x2=81.3,P<0.001）。 3讨论 目前HBeAg和HBV DNA水平是反映患者乙肝病毒复制的主要指标，其中有HBV DNA定量检测对抗病毒治疗效果及预后判断尤其重要。但在实际过程中，往往出现HBV病毒变异，使得患者血清中保留着低水平的HBV DNA。Michael Bruns等3通过鸭肝模型研究也发现，含有嗜肝病毒血清的感染性不仅依赖于具有感染性的Dane颗粒的多少，而且还依赖于缺乏核酸、富含大蛋白的的亚病毒颗粒（SVPS，subviral particles）的数量，这些颗粒能够显著增强细胞内的病毒复制和基因表达。 HBV大蛋白包括HBsAg、PreS1、PreS2蛋白，是乙肝病毒Dane颗粒和亚病毒颗粒的主要包膜成份，与乙肝病毒复制密切相关，乙肝病毒大蛋白的检测结果是反映患者血清中是否存在Dane颗粒和亚病毒颗粒，因而对判定HBV感染者体内HBV复制或传染性可能具有更重要的意义，文献表明前S蛋白具有复杂的跨膜拓朴结构2，利用针对蛋白线性表位制备的单克隆抗体来检测血清大蛋白，往往容易造成漏检4，我们采用针对HBV大蛋白特殊构象制备的单克隆抗体对179例HBV感染者血清中HBV大蛋白检测,结果显示HBV LP阳性率和HBV DNA阳性率差异无统计学意义（P>0.05），因而可以作为反映病毒复制情况的一个血清学指标，在HBV DNA阴性的标本中有19例HBV LP阳性，原因可能是在检测HBV LP时不仅能检测到Dane颗粒，还能检测到Dane颗粒以外的亚病毒颗粒，亚病毒颗粒数量水平较高，在血液中的消退时间也晚于Dane颗粒5，另一方面是本实验中应用的荧光定量PCR试剂灵敏度较低造成低水平的HBV DNA漏检。 传统的观念认为HBeAg阳性表明乙肝病毒感染者体内病毒复制活跃，病毒数量多，传染性强，HBeAg转阴往往预示着HBV复制的停止，后来的研究表明，在HBeAg阴性的慢性乙型肝炎中，由于病毒DNA发生了前C区或BCP区的变异，导致了HBeAg合成障碍5。我们的实验结果显示HBV LP阳性率87.5%，明显高于HBeAg阳性率50.7%（P<0.001），显然在判断病毒复制和传染性方面，HBV LP比HBeAg具有明显的意义，在不具备HBV DNA检测条件的基层医院，HBV LP可以用作判断病毒复制的理想血清学指标。 综上所述，HBV大蛋白检测操作简便、快速、可以作为病毒复制的免疫学指标，适合在基层医院推广应用。 参 考 文 献 1Bang G, Kim KH, Guarnieri M, Zoulim F, Kawai S, Li J, Wands J, Tong S. Effect of mutating the two cysteines required for HBe antigenicity on hepatitis B virus DNA replication and virion secretion. Virology 2005;332(1):216-224. 2Lambert C.et al. Assessment of determinants affecting the dual topology of hepadnaviral lare envelope proteins J.General Virology 2004, 85:1221-1225. 3Bruns M, Miska S, Will H. et al. Enhancement of hepatitis B Virus infectionbynoninfectionssubviral particles .J Virol,1998,76:1462-1468. 4彭建明,李金明.病毒样颗粒在免疫测定中的应用研究进展J.中华检验医学杂志,2005,28:214-216. 5Carman WF, Jacy