人结肠癌SW480裸鼠肝转移模型的建立.doc

人结肠癌SW480裸鼠肝转移模型的建立 作者：牛洪欣何庆泗冷永德刘英姿 【关键词】 结直肠肿瘤 肝肿瘤 肿瘤转移 小鼠 裸 肝脏是结直肠癌最常见的靶向转移部位，肝转移成为结直肠癌患者死亡的最主要因素1，虽已有大肠癌早期肝转移的预测研究报告，但以人结直肠癌细胞在裸鼠体内建立肝转移模型，已成为研究结直肠癌肝转移机制和抗转移治疗的主要实验方法。本研究模拟结直肠癌切除术后癌细胞回流入门静脉至肝脏血道播散而发生肝转移的过程，采用脾脏种植法建立SW480裸鼠肝转移模型。 1 材料与方法 1.1实验动物和细胞株46周龄BALB/C裸鼠24只，雌性，体质量1218 g，购自山东大学实验动物中心，饲养于SPF环境下。人结肠癌细胞株SW480，购自第四军医大学。 1.2结肠癌肝转移动物模型的建立 1.2.1收集制备细胞悬液人结肠癌SW480细胞培养于RPMI 1640含新生牛血清（体积分数10%）的培养液中，置于37 、含5% CO2的培养箱内恒温孵育传代，获得足够细胞数量后，选择生长状态良好，约80%汇合的细胞进行收集，制成5107ml-1的细胞悬液，冰浴至脾内接种。 1.2.2脾内种植（保留脾脏）法建立结肠癌肝转移动物模型裸鼠称重，用1%戊巴比妥钠45 mg/kg腹腔内注射麻醉，手术野皮肤消毒，左背部斜切口（左腋后线与肋缘交界下方）0.51.0 cm，进腹暴露脾脏后，将脾下极轻柔地提出腹腔，用5号针头将结肠癌SW480细胞缓慢注入裸鼠脾脏，每只裸鼠注射细胞悬液0.2 ml（即1107/只），注射时间约3 min，可见脾被膜肿胀、变白，注射完毕拔针后以75%乙醇棉棒压迫针眼2 min，以压迫止血和杀灭可能外渗的癌细胞，防止腹腔内种植转移。将脾脏放回原位，关腹。麻醉清醒后常规饲养。整个操作过程遵循无菌操作原则。 13疗效观察定期观察裸鼠的一般状况。分别于接种后第1、2、3和4周各处死3只裸鼠，剩余裸鼠待其自然死亡，观察生存期。所有裸鼠均进行尸解，观察有无肝及其他部位转移，取出肝脏、脾脏及有转移的其他组织，以4%甲醛固定，石蜡包埋，切片后行常规病理组织学检查。 2结果 2.1裸鼠一般状况术后24只裸鼠全部成活，术后第3天称量体质量，各裸鼠均有所下降，到术后第6天基本恢复到术前水平。术后第3周，部分裸鼠体质量下降、消瘦、少动、进食量减少。第4周绝大部分裸鼠明显消瘦、弓背、行动迟缓、精神萎靡，严重者出现衰竭、死亡。各裸鼠后期均有恶病质表现，其中5只出现腹水，2只出现便血。 2.2肝转移率尸检发现24只裸鼠肝脏上均有转移瘤形成，肝转移率为100%。 2.3肝转移瘤生长情况术后第1周处死的3只裸鼠肝脏表面肉眼均可见针尖大小、散在分布的灰白色微小转移灶；第2周处死的裸鼠肝脏表面瘤结节呈小米粒样；第3周处死的裸鼠肝脏表面瘤结节增大，弥散分布；第4周处死的裸鼠肝脏表面瘤结节明显增大且大小不一；自然死亡时，肝脏表面及切面均有灰白色转移灶。转移瘤数目差异较大，部分裸鼠转移结节融合成孤立的大块，最大2.4 cm2.1 cm，表面有破溃（图1），部分裸鼠呈多发的粟粒样小结节，难以计数（图2）。肝表面转移结节主要位于肝叶边缘和肝叶脏面，以右叶多见。肝体积变小，质脆硬，部分肝组织被转移结节替代。 2.4脾脏原位肿瘤形成情况及其他部位转移情况 脾脏接种局部可见大小不一的灰白色结节，直径0.23 cm（图3），原位接种成瘤率为100%。部分裸鼠有淋巴结、膈肌、腹腔等一处或多处转移灶（腹腔内广泛转移1只，图4），腹腔淋巴结转移3只，膈肌转移1只，心、肺、脑、肾等未见转移灶。各部位转移灶均经病理证实来自同一腺癌。 2.5形态学观察 2.5.1大体解剖脾脏原位瘤及肝转移瘤呈灰白色，实质性，圆形或椭圆形，并向周围组织浸润，剖面呈鱼肉状，较大瘤体中央有坏死区。 2.5.2光镜观察肝转移瘤切片中看不到正常的肝小叶结构。癌细胞生长活跃，呈明显异形性，胞核圆形、居中，核大、深染，核分裂相增多，胞质少，聚集成团，伴有癌结节形成，纤维组织增生及炎细胞浸润较少，与脾脏上肿瘤结节的形态结构相似，符合低分化腺癌的结构特征。部分区域变性坏死、肿瘤细胞结构不清，坏死组织中可见大量炎细胞（图5）。 2.5.3电镜观察肿瘤细胞呈不规则形，体积较大，核大，核仁明显，核分裂相易见，胞质内细胞器丰富，内质网、线粒体等增多（图6）。肝转移瘤细胞与脾脏原位种植瘤细胞超微结构相似。 2.6生存期12只荷瘤裸鼠自然生存时间为2440 d，平均（34.726.49）d。 3讨论 实验性结直肠癌肝转移模型的建立主要有脾脏种植法和盲肠壁种植法。其他接种途径尚有门静脉内、回结肠静脉、肝脏注入等，但均因操作困难或其他原因而较少应用。盲肠壁种植法肿瘤转移范围较广，肝转移发生率相对低，且肝转移发展过程较慢；脾脏种植法肝转移发生率极高，可达100%，较少有肝外其他脏器转移，且肝转移发展过程较快。 根据脾脏接种肿瘤细胞后是否保留，脾脏种植法分为脾脏保留法和脾脏切除法。本法保留脾脏，虽然存在并发的脾脏原位肿瘤，但同时也保留了脾脏的免疫功能，保留了宿主固有的抗肿瘤免疫，更符合肿瘤在人体内发生发展的复杂环境。 建立裸鼠肿瘤肝转移模型时，应注意以下几点。1）体外培养和制备悬液时，要尽量保持原肿瘤细胞的生物学特性。肿瘤细胞经过酶消化和处理后，其表面的某些成分发生变化，影响肿瘤细胞生长与转移的潜能。因此，酶消化的时间要控制好，吹打细胞要轻柔，离心速度不要超过1 000 r/min。2）切口选择在背侧中部，0.51.0 cm即可，创伤小，极易显露脾脏，操作简便安全。3）注射时应将脾脏下极拉出切口外，从下极沿脾长轴水平进针，深度达0.5 cm以上，这样不易穿破脾脏，悬液也不会从注射部位溢出。4）注射细胞数量要足够，达到1107/只。因为植入的肿瘤细胞必须逃逸大量活化的、能分泌肿瘤坏死因子的吞噬细胞及自然杀伤细胞的攻击后才能造成血管侵袭、肝转移。5）注射时间要够长，至少3 min，以免脾被膜张力过大而破裂。 本实验应用人的结肠腺癌细胞株构建结肠癌肝转移模型, 其肝转移瘤出现早，转移率高达100%；肝转移靶向性强，很少有其他部位转移；动物晚期均有恶病质表现；病理显示肝转移瘤组织学结构与人结肠腺癌完全一致。以上结果证实在裸鼠的肝转移中并没改变原人结肠癌细胞具有的侵袭、转移等生物学特性。本模型对结肠癌肝转移的基础与临床研究都有较好的应用价值。【参考文献】 1 Otchy D, Hyman NH, Simmang C, et al. Practice paramet