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人乳头状瘤病毒持续感染与宫颈癌变相关的危险因素【摘要】 宫颈癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤，高危型人乳头状瘤病毒（HPV）持续感染与宫颈上皮内瘤样病变及宫颈癌的发生密切相关。研究发现高危型HPV是否产生持续感染不仅与HPV基因变异及其性状改变有关，宿主自身免疫反应、遗传因素的变化对其亦具有决定性影响。上述HPV持续感染危险因素的研究正方兴未艾，有望在宫颈癌相关诊断、预后标志物方面实现突破。全文对近年来该领域的相关进展做一综述。 【关键词】 宫颈肿瘤 人乳头状瘤病毒 基因变异 整合 免疫逃逸 遗传易感性 宫颈癌是常见的妇科肿瘤，严重地威胁着女性的生命健康。大量流行病学研究证实，人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是宫颈癌发生发展的重要环境因素。然而在感染HPV的妇女中，大多数可自行消退，仅少数妇女发展为持续性感染，并进展为宫颈上皮内瘤样病变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN），甚至宫颈癌，这说明在宫颈癌的发生过程中，还有其他一些危险因素发挥作用。近年来研究表明，除环境与生活方式等外界因素外，宿主与病毒本身的变异因素很可能与疾病的发生发展有一定的相关性。深入理解HPV和宿主因素在宫颈癌发病机制中的作用及其相互关系，对于早期辨别存在HPV持续感染、宫颈病变可能恶性变的高危妇女具有重要意义。本文主要对导致宫颈癌相关HPV感染持续状态的病毒和宿主因素及其相互关系进行综述。 1 病毒因素 HPV是一种小型无包膜DNA病毒，具有双链闭环的DNA基因组。目前已鉴定的HPV DNA约有130余种, 其中40多种与生殖道感染和病变有关。根据致病力大小，HPV可被分为低危型与高危型两种。低危型（如HPV6、11、30型等）可引起尖锐湿疣、扁平湿疣等良性病变；而高危型HPV（如HPV16、18、31、58型等）主要导致CIN、级病变和宫颈癌的发生。在宫颈癌组织中高危HPV的检出率达99%1，提示HPV感染是宫颈癌发病的重要因素。 1.1 HPV基因变异 迄今为止，大量研究已证实不同HPV型别具有不同的致病能力，因此，有理由认为特定的致癌高危HPV型别的型内变异也可能具有不同的致癌能力。尽管有超过100余种HPV被确定，但对于病毒基因变异的研究目前主要集中在HPV16型。根据系统发生学的分类方法，通过分析病毒上游调控区（URR）的核酸序列可将HPV16按其来源分为欧洲型（E），亚洲型（As），亚美型（AA），非洲型（Af1）和非洲型（Af2）。目前研究2证实HPV16基因变异型有不同的致癌能力，欧洲型被认为是低危型别。Berumen等3发现墨西哥妇女中 HPV16 AA型在宫颈癌中的感染频率较正常对照高21倍，而 HPV16 E型在宫颈癌中的感染频率只较正常对照高2.7 倍，HPV16 AA型患宫颈癌的相对危险度（OR=27.0）显著高于 HPV16 E型（OR=3.4），因此推测墨西哥人群中HPV16 AA型的高度分布可能是导致其宫颈癌高发的一个重要原因。近年来亦有研究4提示特定的HPV16 E6变异亦可能具有较高的患宫颈癌风险性，尽管HPV16 E6变异类型的分布在各国或地区不完全一样，但变异体都较原型的致癌性增强这一点是相同的。另外，少量研究提出其它高危HPV型别（如HPV18、31、58等）的基因变异也是诱发宫颈癌的高危因素5。但由于对其它HPV型别基因变异的研究极为稀少，故尚需要进一步的多中心研究证实其统计学意义。 除外上游调控区和E6基因，目前对于HPV基因组其它区域（即L1、L2、E7等）变异模式的研究较少。研究人员应着眼于对HPV阳性标本进行全基因组测序工作，以便更好地定义与宫颈癌发病确切相关的HPV基因组变异位点，这将有助于靶向病毒基因组突变区域进行体外功能研究。只有通过这些功能研究，流行病学的生物学机制才能得到进一步阐述。 1.2 HPV整合 大量研究发现，高危型HPV DNA整合6到宿主基因组将导致宿主细胞产生包括抑癌基因功能缺陷、基因组不稳定性和细胞永生化等一系列不可逆的链式反应，是宫颈癌变的重要机制之一。 HPV整合可以发生在不同的HPV开放阅码框（ORF），造成病毒基因序列的断裂或缺失。HPV DNA断裂整合常发生在E1和/或E2区，使得这两种基因转录产物中的一种或两种同时丢失，其中以E2基因的破坏尤为重要。HPV E2基因编码一360个氨基酸左右的DNA结合蛋白，对HPV致癌基因E6、E7的转录起着负性调节作用。HPV整合所致的E2基因缺失会引起E6、E7蛋白过度表达，使HPV转化能力增强7。除此之外，HPV整合还可导致宿主细胞基因突变和/或表达异常。研究表明HPV在某一特定的肿瘤相关基因区域发生反复整合极为少见，却常常发生于某些细胞基因内含子区域。尽管编码区很少被干扰，但细胞基因表达及其mRNA结构可由于整合插入的HPV基因而受到影响。已发现因HPV整合发生断裂的细胞基因有MYC、TP63、NR4A2、FANCC、hTERT等8，这些基因改变在恶性肿瘤的发生发展中有一定作用。 与HPV相关的宫颈病变向着宫颈癌方向发展反映了一个典型的选择模式。最近对大量的临床标本进行研究，发现在宫颈癌前病变的进展过程中，DNA非整倍体的发生明显先于DNA整合的发生，支持了HPV病毒的整合是染色体修复的结果这一观点9。有研究提示HPV整合状态的检测可作为一个有价值的肿瘤标记或复发标记，在治疗后对组织进行检测还可能有助于提示肿瘤残留，从而指导下一步治疗。然而，其临床价值尚需进一步研究确定。 1.3 病毒负荷量 有关将检测HPV负荷量作为一种致病危险因素和宫颈癌诊断工具的观点一直以来倍受争议。虽然有流行病学调查证明HPV负荷量与宫颈癌患病风险存在关联10，但评价长期病毒负荷状态与HPV感染进展为CIN、级和宫颈癌相关性的纵向研究数据较缺乏11，因此，是否将HPV负荷量作为宫颈癌变的预测指标尚需进一步研究证实。导致病毒负荷量意义不确定的原因在于不同的研究采用了各不相同的取样、检测方法和组织分类标准，使相关数据的分析和比较复杂化。例如，HC-是否能作为HPV感染（尤其是多种HPV感染）的定量方法目前尚不统一，因为HC-并不能精确地辨别HPV类型。另外，由于HPV持续感染和一过性感染都可能表现出高HPV负荷，故常常使得人们不能准确评判HPV感染状态。 在有关HPV病毒负荷的后续研究中，需要应用能够分型的新型病毒定量方法，如动态PCR法12，建立标准的标本收集和检测方法，以助于对研究数据进行更有效的统计学检验。另外，有关病毒负荷与宫颈形态学异常的相关性、不同HPV类型的病毒负荷差异以及HPV负荷与宫颈癌变之间的时相关联等问题亦应受到关注，是否将病毒负荷作为细胞学假阴性患者的辅助指标也值得临床进一步探索。 2 宿主因素 Mouoz等13对1 000多名妇女进行追踪研究，结果证明高危型HPV感染妇女的患病风险明显增加，但高危型HPV的致病风险不因HPV型别而有明显差异，反而与患者的自身状况密切相关，由此证明一些宿主因素，包括免疫反应、遗传背景等在HPV感染转归以及宫颈癌发生发展过程中起决定性作用。 2.1 免疫反应 大多数HPV感染可以自然清除，提示HPV感染可激发宿主产生足够的免疫防御机制对抗病毒。宿主的免疫反应对HPV感染的转归起决定性作用，直接影响到HPV感染是否被清除或转化为持续性感染。 HPV感染并不是全身性的，而是局限于起始的感染部位。因此，对HPV感染的第一道防线是通过宫颈黏膜表面。与HPV感染相关的宫颈病变，多表现为炎症细胞浸润减少，细胞因子水平下降等，这提示与高危型HPV感染相关的部位处于免疫忽视状态。自然杀伤细胞(NK细胞)在感染早期杀伤病毒感染的靶细胞，其杀伤活性不受MHC限制。在HPV16感染引起的癌前病变和恶性病变中，NK细胞对感染HPV形成角质的细胞的杀伤活性下降，而自发清除HPV感染的患者NK细胞活性正常。Sherif等14用RT-PCR技术检测11例正常宫颈组织和25例HPV16型阳性的CIN标本中表皮和表皮下IFN-和IL-10 mRNA的表达水平，发现CIN中IFN- mRNA的表达显著低于正常宫颈组织，而IL-10 mRNA的表达则显著高于正常宫颈组织，提示HPV16感染时不恰当的细胞因子合成可能使局部免疫应答偏离Th1应答方式，这与宫颈癌的发生和发展有关。IL-18是一种重要的细胞因子，巨噬细胞是其主要来源。IL-18可诱导产生IFN-，刺激Th1细胞反应，并诱导产生病毒特异的CTL，IL-18还可诱导TNF的表达。有研究提示HPV16的E6、E7蛋白可以通过竞争性抑制机制，阻止IL-18与其受体链的结合，抑制IL-18诱导单核细胞和NK细胞产生IFN-，这可能是HPV逃避免疫监视的一种方法15，16。 朗罕氏细胞(LC)是位于表皮的一种抗原提呈细胞，它可介导局部的CD4+ T细胞反应。宫颈癌和癌前病变多发生在宫颈移行带。近来有学者发现，移行带中未成熟LC密度与宫颈外口相比显著降低17。来自于移行带和CIN区的LC在受到同样的刺激后，诱导产生的细胞增生和IL-2水平低于来自宫颈外口的LC，而所产生的免疫抑制因子IL-10则呈高水平，提示宫颈移行带区LC密度下降和细胞因子、趋化因子表达的改变将引起移行带的免疫监视水平下降18。 2.2 遗传易感性 对于宫颈癌遗传背景，人们最初注意到的是HLA基因家族。HLA分子是参与抗原加工、处理和提呈的关键分子，从而参与机体的免疫应答和免疫调节。HLA基因群定位于人类第6号染色体的短臂（6p21.31），全长3.6Mb，约占人类整个基因组的1/3000。HLA 复合体结构十分复杂，表现为多基因性和多态性。根据HLA复合体中基因座在染色体上的分布情况及其所编码分子的功能差异，HLA复合体可分为、三类基因。迄今，对HLA与宫颈癌相关性的研究大多都局限于HLA 类基因，其中研究最为集中的是3组 HLA 类等位基因：第一组：DRB1*13(含有DRB1*13011305等位基因)与DQB1*0603；第二组：DRB1*1501和DQB1*0602；第三组：DQB1*03(包括DQB1*03010303)。研究发现后两组等位基因可以增加宫颈癌的发病风险19，而对不同地区妇女的多项研究一致发现 DRB1*13和/或DQB1*0603对宫颈癌的保护性作用。尽管这方面研究结论一致，但现在还不清楚这些等位基因的单独效应，进一步探明需要更大规模研究。 单核苷酸多态性(SNP)是新一代分子遗传标记，目前认为基因的SNP和特定SNP组合是影响复杂性多基因遗传病的发病风险的最重要原因，而相关SNP位点和宫颈癌遗传易感性的研究热潮至今方兴未艾。p53是最早被研究的与宫颈癌遗传背景相关的抑癌基因。p53基因72位密码子的多态性(C/G)导致所编码氨基酸的不同，p53-Arg比p53-Pro更易于被HPV的癌蛋白E6降解。来自不同地区的研究均认为p53基因72位密码子的多态性与宫颈癌的易感性有关20，21，然而，在其他的种族人群中（如欧美和亚非拉地区），p53基因多态性与HPV相关的宫颈癌发病风险之间的关系尚未得到肯定。近来，代谢解毒基因和其他免疫相关基因也进入SNP位点研究领域。有学者22研究认为纯合的谷胱甘肽转移酶GSTM1空白基因型比GSTM1阳性杂合基因型的女性罹患宫颈癌的风险高3.3倍。Au等23分别对美国和委内瑞拉女性进行研究，发现GSTM1无效基因型对于美国女性增加宫颈癌的发病风险,而对于委内瑞拉女性则不增加风险,说明同一易患因素对于不同种族和人群可能有不同作用。目前，其他SNP位点与宫颈癌发病的关系亦在进一步探索和研究中。 3 结 语 毫无疑问，随着对导致高危妇女产生HPV持续感染的病毒和宿主因素识别和探索工作的进一步深入，将有望在选择、确定宫颈癌相关诊断、预后标志物方面实现突破。有研究报告p16INK4a在HPV持续感染导致的CIN、和正常宫颈组织中的表达具有显著统计学差异，可以敏感而特异地区分两者，被视为高危HPV感染的标志物24。然而，有关将其作为CIN、预后标志的阳性预测值及敏感度等问题目前仍未确定。因此，这些候选标志物的临床效用价值尚需得到进一步研究来证实。 宫颈癌的发生是一个多因素多步骤作用的过程，高危HPV变异及其性状在宫颈癌的发生过程中起着不可忽视的作用，而宿主自身免疫反应、遗传因素对疾病的进展也有着决定性的影响。对上述病毒和宿主因素的评估将有助于将HPV持续感染的高危妇女从庞大的HPV感染人群中筛选出来并及早干预，对宫颈癌的预防、诊断、预后判断及疫苗设计具有重要意义。【参考文献】 1 Cuschieri KS, Cubie HA, Whitley MW, et al. 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