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他克莫司对移植肝脏再灌注损伤的影响 作者：王东 朱继业 栗光明 黄磊 朱凤雪 冷希圣【摘要】 目的 探讨他克莫司对移植肝脏再灌注损伤的影响。方法 建立大鼠肝移植模型，实验组（40只）和对照组（40只）分别注射他克莫司和生理盐水，检测再灌注24、48和96 h后TNF-、IL-1、ALT、AST、LDH、内皮素（endothelin,ET）和丙二醛（malondialdehyde,MDA）水平，观察肝脏超微结构和细胞凋亡情况，RT-PCR法检测Fas、Bcl-2的mRNA水平。依据免疫抑制方案，将112例终末期肝硬化患者分为他克莫司组（63例）和环孢素A组（49例），比较临床肝移植使用环孢素A和他克莫司患者肝酶指标及急性排斥反应的发生。结果 实验组TNF-、IL-1、ALT、AST、LDH、ET和MDA显著低于对照组（P0.05），肝脏超微结构受损和细胞凋亡较轻，Fas mRNA合成减少。患者使用他克莫司后急性排斥反应发生率较环孢素A低（2=39.0，P0.05）。结论 他克莫司可通过抑制细胞凋亡来减轻大鼠移植肝脏再灌注损伤，临床使用他克莫司能减少急性排斥反应的发生。 【关键词】 肝移植； 再灌注损伤； 他克莫司Effects of tacrolimus on reperfusion injury in orthotopic liver transplantation 【Abstract】 Objective To investigate the effects of tacrolimus on reperfusion injury in orthotopic liver transplantation. Methods The rat models of orthotopic liver transplantation were established. SD rats in experimental group （n=40） were injected with tacrolimus while control group （n=40） with normal saline. The serum levels of TNF-, IL-1, ALT, AST, LDH, endothelin （ET） and malondialdehyde （MDA） were detected at 24, 48, 96 hours after reperfusion. Ultrastructural changes and cellular apoptosis of liver and synthesis of mRNA of Fas and Bcl-2 were checked. According to the immunosuppression regimen, 112 patients with end-stage liver cirrhosis were divided into tacrolimus group （n=63） and cyclosporin A group （n=49）. The levels of hepatic enzymes and the rate of acute rejection in patients of the two groups after liver transplantation were compared. Results Levels of TNF-, IL-1, ALT, AST, LDH, ET and MDA in experimental group were significantly lower than those in control group （P0.05）. Rats in experimental group had less Fas mRNA synthesis, minor liver ultrastructure lesion and cellular apoptosis than control group. Compared with cyclosporin A group, acute rejection was decreased in tacrolimus group （2=39.0, P0.05）。1.3 测定指标及方法 7170A全自动生化分析仪（日本HITACHI公司）测定血清ALT、AST、LDH水平，1470全自动计数仪（美国Pharmacia公司）测定TNF-、IL-1和内皮素（endothelin,ET）水平，硫代巴比妥酸法测定丙二醛（malondialdehyde,MDA）水平。TUNEL法检测肝组织切片的细胞凋亡，RT-PCR法检测肝组织匀浆Fas和Bcl-2的mRNA水平。1.4 统计学分析 实验数据采用xs表示，使用SPSS 10.0软件对各组数据进行t检验。P0.05为差异有统计学意义。2 结果2.1 大鼠移植肝脏再灌注后实验室检测 再灌注后两组TNF-、IL-1、ALT、AST、LDH、ET、MDA均升高，但实验组低于对照组（P0.05），见表1。表1 大鼠移植肝脏再灌注后各血清学指标的比较（略）2.2 肝组织形态学及细胞凋亡的检测 随着移植肝脏再灌注时间延长，肝细胞内线粒体和内质网浊肿逐渐加重，线粒体内膜嵴减少，外膜变得不完整，严重者整个肝细胞呈空泡样变性，细胞核染色质浓聚，肝窦内皮细胞出现断裂，严重者脱落填塞肝窦腔。实验组肝细胞和肝窦内皮细胞超微结构的改变轻于对照组（图1，2）。 正常肝脏绝大多数细胞TUNEL染色阴性，细胞核为蓝色，再灌注后肝细胞和肝窦内皮细胞均可发生凋亡，TUNEL阳性细胞的细胞核染为棕褐色（图3，4）。在显微镜下每张切片计数10个视野的细胞，凋亡指数（AI）=凋亡细胞数/计数细胞总数100%。结果发现，实验组再灌注后24 h的凋亡指数为（21.73.2）%，显著低于对照组的（29.58.3）%，差异有统计学意义（t=2.0，P0.05）。2.3 凋亡调控基因的检测 采用RT-PCR法检测Fas和Bcl-2的mRNA水平，结果如图5，6所示。正常对照肝脏（图5、6第3和第8条带）由于无细胞凋亡而未检测出Fas和Bcl-2的mRNA表达，再灌注后两组的Fas和Bcl-2的mRNA合成均增加，实验组Fas mRNA水平显著低于对照组（P0.05），两组Bcl-2 mRNA水平比较差异无统计学意义（表2）。表2 大鼠移植肝脏再灌注后Fas和Bcl-2的mRNA表达（略）2.4 临床肝移植血清ALT、AST、LDH和急性排斥反应 全组肝移植患者术后定期检测血清ALT、AST、LDH，发现他克莫司组ALT、AST、LDH恢复正常的平均时间为（12.24.6）d，明显短于环孢素A组的（17.46.3）d（t=5.0，P0.05）。术后1个月他克莫司组有6例发生急性排斥反应，发生率10%（6/63）；环孢素A组有7例，发生率14%（7/49），两组比较差异有统计学意义（2=39.0，P0.05）。3 讨论 移植肝脏再灌注时由于钙离子超载，多种水解酶激活而导致线粒体功能障碍和细胞内环境紊乱，肝细胞和肝窦内皮细胞均受损。内皮细胞受损后ET、选择素、细胞间黏附分子-1等释放增加，进一步激活炎性细胞释放细胞因子TNF-、干扰素-、IL-1等，上调主要组织相容性复合物，增加肝脏免疫原性。因此，再灌注损伤不仅可影响移植肝功能，也可增加急性排斥反应的风险3。 我们在大鼠肝移植模型中观察到，使用他克莫司后移植肝脏再灌注损伤得到改善，同时TNF-和IL-1等炎症因子也明显减少。这提示他克莫司能抑制再灌注损伤的炎症链式反应。有文献报道他克莫司可通过与皮质类固醇受体相连的热休克蛋白结合，保护皮质类固醇受体不被降解，与皮质类固醇发挥协同作用减少多种细胞因子和氧自由基的生成，降低中性粒细胞的聚集和细胞黏附分子的合成来减轻缺血再灌注损伤，这种保护作用已在多种脏器中得到证实4-6。本实验证实他克莫司对移植肝脏具有类似保护作用。近来研究发现凋亡是再灌注损伤的重要病理特征，其发生受多种凋亡调控基因影响。本研究发现移植肝脏凋亡细胞数量随再灌注时间延长而增加，实验组明显低于对照组，同时Fas mRNA的合成较对照组减少。这提示他克莫司可能通过对凋亡调控基因的影响而减少凋亡发生。在临床肝移植中，他克莫司较环孢素A更能有效地降低肝移植术后急性排斥反应，除与其较强的免疫抑制作用有关之外，可能也与其减少移植肝脏再灌注损伤有关。在边缘供者如脂肪肝移植中他克莫司的这种保护作用更为突出7。 综上所述，他克莫司有可能通过抑制再灌注过程中细胞因子释放和抑制凋亡来减轻移植肝脏再灌注损伤，有助于移植肝功能恢复和急性排斥反应减少。【参考文献】 1Oltean M, Pullerits R, Zhu C, et al. Donor pretreatment with FK506 reduces reperfusion injury and accelerates interstinal graft recovery in rats. Surgery,2007,141（5）:667-677.2Treska V, Molacek J, Kobr J, et al. Ischemic training and immunosuppressive agents reduce the intensity of ischemic reperfusion injury after kidney transplantation. Exp Clin Transplant,2006,4（1）:439-444.3纪志鹏，徐克森，刘毅，等.共刺激分子B7-1、B7-2在大鼠热缺血再灌注肝脏表达意义的研究.中国现代普通外科进展，2006，9（3）：151-153.4Squadrito F, Altavilla D, Squadrito G, et al. Tacrolimus limits polymorphonuclear leucocyte accumulation and protects against myocardial ischaemia-reperfusion injury. J Mol Cell Cardiol,2000,32（3）:429-440.5Treska V, Molacek J, Kuntscher V, et al. Immunosuppressive agents have an influence on ischemia-reperfusion injury in kidneys procured from a non-heart-beating donor: experimental study. Transplant Proc,2004,36（10）:2931-2934.6Sasaki K, Miyake H, Kinoshita T, et al. Protective effect of FK506 and thromboxane synthase inhibitor on ischemia-reperfusion injury in non-heart- bea