反义AT1R重组腺病毒对人肺动脉平滑肌细胞增殖的影响.doc

反义AT1R 重组腺病毒对人肺动脉平滑肌细胞增殖的影响 作者：许大国, 朱润庆, 涂明利 摘要 目的: 研究腺病毒介导反义AT1R cDNA转染对人肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）增殖的影响。方法: 构建重组反义人AT1R腺病毒(AdCMVahAT1)和表达-半乳糖苷酶的对照载体AdCMVLacZ，将培养的PASMCs分为DMEM组、AT组、AdCMVLacZ+AT组和AdCMVahAT1+AT组，分别给予相应的干预因素，用RT-PCR和免疫组化检测AT1R的表达，用流式细胞仪检测各组PASMCs的增殖指数。结果:转染病毒后48 h AT1R蛋白表达在AdCMVahAT1组显著低于AdCMVLacZ组和DMEM组。给予AT刺激48 h，AT组PASMCs的增殖指数（59.693.46）高于DMEM组（50.251.34，P0.01），转染AdCMVahAT1后再用AT刺激48 h的AdCMVahAT1+AT组PASMCs的增殖指数（24.673.19）则显著低于3个对照组（P0.01）,而AdCMVLacZ+AT组（59.533.26）和AT组比较无显著性差异。结论:反义AT1R通过抑制AT1R的表达而抑制PASMCs增殖。 关键词 反义AT1R；肺动脉；平滑肌细胞；增殖Abstract: Objective To investigate the influence of human angiotensin (AT) type 1 receptor (AT1R) antisense cDNA (ahAT1) on proliferation of cultured human pulmonary artery smooth muscle cells (PASMCs). Methods Two recombinant adenoviral vectors, AdCMVahAT1 containing full length antisense cDNA targeting to human AT1R mRNA, and AdCMVLacZ containing LacZ, were constructed by orientation clone and homologous recombination. The PASMCs was divided into 4 groups (DMEM，AT，AdCMVLacZ+ATand AdCMVahAT1+AT) and corresponding intervention were given to different groups, respectively. AT1R expression was detected by RT-PCR and immunohistochemistry method. Proliferation index (PI) were determined by flow cytometry. Results After transfected 48 h, AT1R expression was significantly less in PASMCs transfected AdCMVahAT1 than that in group DMEM and in group AdCMVLacZ (P0.01). Stimulated by ATII for 48 h, in group AT the PI of PASMCs markedly increased (P0.01 Vs group DMEM). However, in group AdCMVahAT1+AT, PI of PASMCs markedly decreased (P0.01 Vs group AT and group DMEM, respectively). There were no significant differences of PI between group AdCMVLacZ+AT and group AT. Conclusion Human AT1 receptor antisense cDNA may decrease proliferation in human PASMCs by inhibiting AT1R expression.Key words: Antisense AT1R; Pulmonary artery; Smooth muscle cell; Proliferation肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)肥大增殖，肌型血管中层增厚，非肌型血管向肌型转化，是肺血管重建、肺动脉高压(PAH)形成的重要环节1。血管紧张素（AT）是PASMCs结构和功能异常及肺动脉重建的关键因子之一，其作用主要通过其1型受体（AT1R）而实现2。研究表明，FAK3、BMP4、DCA5可以抑制PASMCs增殖，从而逆转PAH的血管重建。然而，重组腺病毒介导反义AT1R对PASMCs的增殖的影响报道较少，我们对此进行了研究，报道如下。1 材料与方法1.1 主要材料、试剂和仪器重组反义人AT1R腺病毒（AdCMVahAT1，滴度8.21014pfu/L）和对照腺病毒载体（AdCMVLacZ，滴度9.01014pfu/L）。兔抗人AT1R抗体购自Santa CRUZ公司，兔抗人SM-actin单抗及免疫组化S-P试剂盒等购自北京中山生物技术有限公司。PCR扩增仪(PERKIN ELMER 5700 Sequence Detectertor,美国)，倒置相差显微镜（Olympus IX-70，日本），彩色图像分析仪（Opten,德国），流式细胞仪（Beckman Epics XL,美国）。1.2 PASMCs的培养及实验分组原代培养的人PASMCs取自胸外科肺癌手术的肺动脉3级分支，采用组织贴壁法培养。经形态学和特异性兔抗人-SM-actin免疫组化鉴定，呈特异性“峰、谷”状生长，所有细胞胞浆内均有被染成棕黄色的丝状物，证实为人PASMCs。传代培养至第4代用于实验。用分子克隆及细菌内同源重组技术，构建、制备反义人AT1R腺病毒(AdCMVahAT1)6。实验分AdCMVahAT1组、AdCMVLacZ组、DMEM组和AT组。待细胞生长至80%融汇时，前2组按感染复数100分别转染AdCMVahAT1和AdCMVLacZ病毒液，DMEM组加等体积DMEM液，37 、5%CO2培养2 h，中间每15 min轻摇1次。2 h后吸出病毒液及DMEM液，加足量含10%小牛血清的DMEM，37 、5%CO2培养48 h用于AT1R表达水平的检测。1.3 AT1R的表达及检测1.3.1 RT-PCR半定量法检测PASMCs的AT1R的mRNA水平:分别把每组3个培养瓶的细胞收集在一起，按试剂盒要求提取各组细胞总RNA，按RT-PCR试剂盒说明检测AT1R的mRNA表达7。AT1R上游引物5-GCACAATCGCCATAATTATCC-3和下游引物5-CACCTATGTAAGATCGCTTC-3，扩增片段为444 bp；-actin PCR作为内参照(扩增片段长度为260 bp)。扩增产物行1.3%琼脂糖凝胶电泳，然后用凝胶图像分析仪检测各组AT1R与-actin条带吸光度（A）的比值。1.3.2 免疫组化和彩色图像分析仪检测PASMCs的AT1R蛋白表达:每组2个玻片，按试剂盒说明进行免疫组化染色（DAB显色，苏木素复染，另设阴性对照片）。镜下观察每一玻片5个不同视野（400）共200个细胞胞浆棕黄色着色的深浅，以计算机图像分析软件UTHSCSA Image Tool 2.0版计算出其平均吸光度（A）值。1.4 流式细胞仪检测增殖指数1.4.1 分组:DMEM组以无血清DMEM代替干预因素；AT组给予AT刺激细胞增殖；AdCMVLacZ+AT组加AT前先加对照载体AdCMVLacZ；AdCMVahAT1+AT组加AT前先加AdCMVahAT1。每组24孔，分别于AT刺激后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h取每组4孔样本进行检测。1.4.2 消化制备PASMCs细胞悬液:调整细胞浓度为1104/ml，接种于4个24孔培养板，每孔1 ml，37 、5%CO2培养24 h。待细胞生长至占瓶底面积30%时，换无血清DMEM液培养24 h，使细胞同步静止于G0期。转染病毒：AdCMVahAT1+AT组和AdCMVLacZ +AT组按感染复数100分别转染AdCMVahAT1、AdCMVLacZ，另外两组加等体积DMEM液，培养4 h。AT刺激：吸出上述病毒液及DMEM液，换含20%小牛血清的DMEM液，每孔1 ml，除DMEM组还要加50 l的DMEM液外，另外三组每孔加DMEM稀释的AT液50 l，使AT终浓度为10-7 mol/L，培养24 h后全部换液，以10%小牛血清培养液继续培养。1.4.3 3H-TdR掺入实验:加AT后12 h每孔加3H-TdR 1 ci，12 h后收集标本，用液体闪烁计数仪检测3H-TdR掺入量。1.4.4 流式细胞仪检测:按上述时相点取样本送检。混匀的单细胞悬液立即以碘化丙啶染色后，进行细胞DNA含量分析，计算出细胞周期增殖指数PI=(S%+G2M%）/（G1%+S%+G2M%）。1.5 统计学处理数据以xs表示，以SPSS10.0软件进行单因素方差分析,组间比较用q检验。2 结果2.1 反义AT1R转染对PASMCs表达AT1R的影响2.1.1 AT1R的mRNA水平:RT-PCR产物电泳结果见图1。AdCMVahAT1组、AdCMVLacZ组和DMEM组的相对灰度值(AT1R/-actin)分别为0.48、0.96和0.97。可见转染AdCMVahAT1组PASMCs的AT1R mRNA表达比对照组低50%。图1 RTPCR产物电泳图（略） M:200 bp ladder marker；1:control；2:AdCMVahAT1；3:AdCMVLacZ2.1.2 AT1R的蛋白表达:(见图2)与DMEM组和AdCMVLacZ组比较，抗AT1R免疫组化显示AdCMVahAT1组胞浆和胞膜棕黄色着色均明显变浅，图像分析仪计算其平均吸光度（A）值为176.3921.63，显著低于DMEM组(310.2129.82，P0.01)和AdCMVLacZ组(306.4530.09，P0.01)，后两组间比较无显著性差异。说明AdCMVahAT1进入PASMCs后表达反义AT1R，抑制AT1R蛋白的表达，且与载体本身无关。2.2 AhAT1R腺病毒重组体对PASMCs增殖的影响2.2.1 3H-TdR掺入实验:见图3，空白对照组（C组）3H-TdR掺入量为4598.7304.5 dpm，AT对照组（D组）加入AT后，3H-TdR 掺入量(5571.4843.5 dpm)与C组比较明显增高（P0.05）；而转染Ad/CMVahAT1之后（A1组）3H-TdR 掺入量（3376.5341.2 dpm）则明显降低（与C组比较P0.01），转染Ad/CMVahAT1之后再加AT的（A2组）3H-TdR 掺入量（3410.3492.8 dpm）仍然降低（分别与C组、D组相比均为P0.05），显示对AT刺激无反应；但转染对照载体组（B1组）对3H-TdR掺入量（4672.8301.7 dpm）无明显影响（与C组相比P0.05），加对照载体后再加AT（B2组）的3H-TdR掺入量为5612.8978.6 dpm（与C组相比P0.05）。这说明反义AT1cDNA有明显抑制PASMCs增殖和AT刺激PASMCs增殖的作用，其抑制作用与腺病毒载体本身无关。图3 3H-TdR掺入实验结果（略） 注：C为对照组;D为AT组;A1为AdCMVahAT1组;A2为AT-AdCMVahAT1组;B1为AdCMVLacZ组;B2为AT-AdCMVLacZ组。与C组相比 *P0.05， 与C组和D组相比*P0.012.2.2 细胞生长曲线:见图4。图4 细胞生长曲线（略） 图4可见，C组体外培养的PASMCs随培养时间延长，细胞生长曲线呈逐渐上升趋势，反映了细胞处于增殖状态，2448 h增殖速率加快，细胞数呈指数增长，至72 h后增殖速率减慢。AT组（D组）细胞数增加更为显著（与空白对照组比：648 h，P0.05；72 h，P0.01），细胞生长曲线明显左移，提示AT刺激了PASMCs的增殖。而AT-AdCMVahAT1组（A组）曲线明显右移，各时相点细胞数较少（在4872 h，与C组比P0.05或P0.01；与D组比P0.01）。AT-AdCMVLacZ组（B组），加AT后仍然表现出AT刺激PASMCs增殖的作用，B、D两组曲线基本重叠。充分说明反义AT1有明显抑制PASMCs增殖的作用，转染反义AT1后再加AT不能纠正这种抑制作用。2.2.3 增殖指数:见表1。表1 PASMCs增殖指数（略）注：C为对照组; D为AT组; A组为AdCMVahAT1组; B组为AdCMVLacZ组；与C组相比 *P0.01;与D组和B组相比P0.01；与A组相比P0.053 讨论PAH是慢性肺心病发生发展的病理生理学基础，肺血管收缩反应增强和肺血管结构重建是PAH形成的基础。PAH血管重建表现为内皮细胞损伤，PASMCs肥大增殖，肌型血管中层增厚，非肌型血管向肌型转化，成纤维细胞增殖和细胞外基质增多等。其中PASMCs增殖是PAH形成的重要环节。AT在PAH形成发展中起着重要的作用。研究表明，缺氧可促进AT释放，导致肺血管收缩反应增强。AT还具有生长因子作用，有较强的促进细胞分裂增生的作用，其通过原癌基因c-fos、c-jun及c-myc引起心脏和血管增生肥大，形成重构而影响生理功能。AT的生物学效应主要通过AT1受体所介导。目前临床上缺乏显著降低PAH的死亡率的治疗措施，针对PAH的基因治疗是研究的热点，可能最具前景。Lin等研究了FAK反义ODNs对PASMCs增殖和凋亡的影响，发现FAK与人PASMCs的增殖有关，反义FAK ODNs可抑制人PASMCs增殖和促使其凋亡3。Zhang等发现BMP部分通过诱导人PASMCs凋亡而发挥抗增殖作用4。然而其抑制人PASMCs增殖和促使凋亡作用均不是通过AT1R这一关键环节而发挥作用的。本实验选择在肺动脉收缩和血管重构中起关键作用的AT1R作为基因治疗的分子靶点，将反义人AT1R重组腺病毒转染体外培养的PASMCs，经RTPCR、免疫细胞化学检测、3H-TdR掺入实验和流式细胞仪检测等多种手段，充分证实了反义AT1R在转录和翻译水平抑制AT1R的表达，能显著抑制PASMCs的增殖，其机制可能是反义AT1R全长cDNA表达载体进入细胞后，转录反义AT1R-RNA，然后被细胞内RNAase降解成多个小片段，分别与靶mRNA互补杂交阻断翻译，并激活细胞内RNAase，导致靶mRNA降解，从而直接和间接抑制AT1R蛋白的表达8。本文结果表明，空白对照组随着培养时间的延长，细胞增殖指数从6 h时的12.931.57增加到48 h时的51.131.26，加入AT刺激后增殖指数有更显著的提高（与空白对照组比P0.01），提示AT呈时间依赖性促进PASMCs DNA的合成，但加入AT前预先转染AdCMVahAT1的AT-AdCMVahAT1组，则见不到AT刺激PASMCs增长的作用，反而在2448 h出现增殖指数的明显下调（与空白对照组比P0.01），而预先转染对照载体的AT-AdCMVLacZ组，加AT后仍然表现出AT刺激PASMCs增殖的作用，说明AdCMVahAT1抑制PASMCs增殖的作用与病毒载体无关，推测可能是反义AT1cDNA作用所致。抑制AT介导的PASMCs的异常增殖，从而干预肺血管重建，对PAH的防治有重要意义2。因此，选择AT1R作为分子靶点进行反义基因治疗可能是防治PAH和肺血管重建的新策略，本研究为今后开展反义AT1R基因转染体内治疗PAH奠定了基础。(文中图2见封二)（略）参考文献1 姚小鹏，李 强，钱卫珠，等.比那地尔与肺动脉平滑肌细胞的增殖和凋亡J.第二军医大学学报,2004,25(1):93-95. 2 关 键，程德云，陈小菊，等.洛沙坦对大鼠缺氧性肺动脉高压的治疗效应J.中华结核和呼吸杂志，2003，26(7)：436-437. 3 Lin CL,Zhang ZX,Xu YJ,et al.Focal adhesion kinase antisense oligodeoxynucleotides inhibit human pulmonary artery smooth muscle cells proliferation and promote human pulmonary artery smooth muscle