垂盆草醇提物对人肝癌细胞HepG2的抑制作用及其机制初探.doc

垂盆草醇提物对人肝癌细胞HepG2的抑制作用及其机制初探【摘要】 目的： 观察垂盆草醇提物(CCW)对人肝癌细胞HepG2生长及其肿瘤相关分子指标的影响。方法： MTT法测定CCW对 HepG2细胞增殖的作用;流式细胞术观察细胞周期的改变;分别用RTPCR及免疫细胞化学法检测CCW对VEGF、cMyc基因及蛋白水平的影响。结果： HepG2细胞的增殖在CCW作用的第24、48和72 h均被显著地抑制;CCW(100、200 gml-1)可使HepG2细胞阻滞于G0/G1期;CCW可显著下调VEGF、cMyc的mRNA及蛋白水平的表达。结论： CCW对HepG2细胞增殖具有明显的抑制作用，并且能阻止细胞进入G2/M期，这可能与cMyc基因表达的下调密切相关;CCW能抑制HepG2细胞的VEGF分泌，初步推测CCW具有抗血管生成作用。 【关键词】 垂盆草; 肝癌; 抗增殖; 细胞周期; 抗血管生成垂盆草(Sedum sarmentosum Bunge)又称卧茎景天，系景天科多年生草本植物，分布于全国大部分地区。垂盆草主要含有垂盆草苷类、黄酮类、三萜类、甾醇、生物碱及糖类。此药性凉，味甘、淡，新鲜或干燥全草入药，主要用于治疗湿热黄疽、小便不利、痈肿疮疡，并且具有抑制炎性渗出，减少肝细胞损伤，降低血清丙基酸氨基转移酶水平，治疗急、慢性肝炎等功效1。近年来，国内外大量研究表明，慢性病毒性肝炎与肝癌(hepatocellular carcinoma)的发生有着密切的联系23，一些传统中草药中的黄酮、生物碱及多糖等成分在抗肿瘤、延长患者生命等方面有着独特的生物活性，不仅能够抑制肿瘤细胞增殖，还能有效抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor， VEGF)和原癌基因cMyc的表达47，而VEGF和cMyc在肝癌的形成、生长、浸润、转移过程中均发挥着重要的作用8。因此，本研究着重观察垂盆草醇提物(CCW)对人肝癌细胞 HepG2生长及肿瘤相关基因VEGF和cMyc表达的影响。1 材料与方法1.1 材料垂盆草购于江苏省药材公司。MTT、蛋白酶(Sigma公司)，RPMI 1640培养基(Invitrogen公司)，小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，Biozol RNA提取剂(BioFlux公司)，MMLV 酶、Taq DNA聚合酶(Promega公司)，VEGF、cMyc 和actin引物由Invitrogen Biotechnology Co., Ltd.(上海)合成，兔抗人VEGF、cMyc抗体、生物素化羊抗兔IgG、SABC试剂盒、DAB检验试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，其余试剂均为国产分析纯。CO2培养箱MCO15AC(Sanyo公司)，真空冷冻干燥机(Matin Christ公司)，酶标仪(BioTek公司)，PTC200 PCR 仪(BioRad公司)，Gel Doc EQ图像分析仪(BioRad公司)，FACS Calibur 流式细胞仪 (BectonDickson公司)。1.2 方法1.2.1 垂盆草醇提物的制备 垂盆草干草500 g，于95%的乙醇5 000 ml中浸泡5 d，纱布过滤，收集药液。重复2次，合并药液，离心取上清，所得上清液经减压蒸发挥去溶剂，再用石油醚经索氏提取法去除脂类，挥去石油醚,再用甲醇溶解，减压蒸干得醇提物。1.2.2 细胞培养 人肝癌细胞 HepG2于含10%小牛血清、青霉素100 Uml-1、链霉素150 gml-1的RPMI 1640培养液，在37 、5%CO2培养箱中培养。1.2.3 细胞增殖能力的检测 将肿瘤细胞培养至对数生长期，计数，调整细胞浓度为1105ml-1，接种于96孔板，80 l孔-1，3 h贴壁后加入终质量浓度分别为 25、50、100、200 gml-1的CCW，同时设0. 1 %DMSO对照组，每组设6个平行孔，将培养板置5%CO2、37 培养箱中培养24、48、72 h后MTT法检测9。1.2.4 流式细胞术检测细胞周期 取对数生长期细胞调成浓度为2105 ml-1，300 l孔-1接种于24孔培养板中，细胞贴壁后加入质量浓度分别为50、100、200 gml-1的CCW，对照组加含0.1%DMSO的同体积培养液，设4个复孔。分别收集对照组和醇提物各剂量作用48 h后的HepG2细胞1106个，70 %乙醇4 固定过夜，PBS清洗，加入含2 %TritonX100、50 gml-1 RNase A的PI溶液，4 避光染色30 min, 上机检测2104个细胞，用WinMDI分析软件分析结果。1.2.5 RTPCR检测肝癌细胞的VEGF和cMyc的mRNA水平 用Biozol试剂分别提取各组HepG2 细胞的总RNA，得到白色沉淀,加入1DEPC水30 l至RNA完全溶解并测定RNA的浓度和纯度。取各组总RNA各2 g分别进行逆转录合成cDNA 。PCR反应体系总体积为25 l，其中含cDNA 1 l，10buffer 2.5 l、MgCl2(25 mmolL-1)2 l、dNTP(10 mmolL-1)0.4 l、引物0.8 l、Taq DNA聚合酶(1 UL-1)1 l。VEGF、cMyc和内参actin基因引物序列分别参照有关文献1012。94 预变性5 min;然后94 30 s变性、58 40 s退火、72 30 s延伸，共30个循环;最后72 延伸7 min。1.5 %琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析仪分析结果。1.2.6 免疫细胞化学法检测VEGF、cMyc蛋白表达 将HepG2细胞贴壁于预先置于6孔板的盖玻片上，加入不同质量浓度(25、50、100、200 gml-1)CCW，用含0. 1 %DMSO的培养液作为对照，37 、5%CO2培养48 h后取出玻片，PBS清洗标本2次，80%丙酮醇4 固定15 min，染色步骤按SABC试剂盒说明书操作，PBS代替一抗作阴性对照。染色结果以细胞浆或核出现棕黄色高出背景的细胞为阳性细胞,每组随机选取10个高倍视野，计算每组的阳性细胞率(阳性细胞数占视野内总细胞数的百分比)。1.3 统计学处理采用SPSS10.0软件进行统计学分析,实验数据以x-s表示, F检验方差齐性后 t检验进行组间比较,P<0.05为差异具有统计学意义。2 结 果2.1 CCW对 HepG2 细胞增殖的影响CCW对 HepG2的增殖抑制效果随着药物作用时间的延长而逐渐增强，在作用24 h和48 h后，最高浓度组抑制作用具有统计学意义(P<0.05)，随着药物作用时间的增加，在72 h各浓度组均有明显的抑制增殖作用(P<0.001)。见表1。表1 CCW对肝癌细胞HepG2增殖的影响Tab 1 Inhibitory effects of CCW on the proliferation2.2 CCW对肝癌细胞增殖周期的影响CCW作用于HepG2细胞48 h后，PI单染后经流式细胞仪进行细胞周期分析(图1)。结果显示，100、200 gml-1CCW能够有效阻滞肿瘤细胞于G0/G1期分别为(67.391.97)%、(70.451.23)%，降低进入G2/M 期细胞的数量分别为(15.462.7)%、(14.201.41)%，与对照组G0/G1期为(60.372.7)%、G2/M 期(20.452.32)%相比，差异具有统计学意义(100 gml-1， P<0.05;200 gml-1，P<0.01。n= 4)。2.3 CCW对HepG2 细胞VEGF、cMyc mRNA表达的影响采用RTPCR法检测VEGF、cMyc的mRNA表达，经扩增的产物VEGF、cMyc和actin的相对分子质量分别为212、200 和 389 bp(图2A)，与内参actin相比，各组相对光密度比值见图2B，100、200 gml-1CCW处理组VEGF mRNA表达较对照组均明显降低，均具有统计学意义(100 gml-1，P<0.01;200 gml-1，P<0.001)。100、200 gml-1CCW处理组cMyc mRNA表达较对照组明显降低，均具有统计学意义(100 gml-1，P<0.05;200 gml-1，P<0.001)。2.4 CCW对VEGF和cMyc蛋白表达的影响细胞浆或核有棕黄色或棕褐色颗粒着色为阳性特征。未加药对照组细胞中表达较强，VEGF和cMyc阳性细胞率分别为(35.783.90)%和(43.218.37)%。在质量浓度100、200 gml-1的CCW作用48 h后，VEGF 阳性细胞率分别为(24.151.93)%和(14.482.83)%，cMyc阳性细胞率分别为(28.675.65)%和(27.993.34)%，与对照组相比，均具有统计学意义(P<0.001)。见图3。A. 对照组;B.50 gml-1组;C.100 gml-1 组;D.200 gml-1组3 讨 论近年来，从祖国传统医药宝库中发掘新的抗癌药物已经成为肿瘤治疗的研究热点之一，并且这些新的抗癌药物在临床中的应用也取得了可喜的进展。垂盆草作为一种重要的药用植物资源，在民间被用于治疗咽喉肿痛、水火烫伤、蛇虫咬伤等已有多年的历史，此外，据文献报道垂盆草还具有免疫抑制作用13、雌激素样作用14、血管紧张素转化酶抑制作用15等，然而，它最重要的一个功效就是能够降低血清丙氨酸氨基转移酶水平，抑制炎性渗出，减少肝细胞的损伤，所以在临床上被广泛用于治疗各型慢性病毒性肝炎16。众所周知，慢性病毒性肝炎是肝癌发生的重要危险因素17，鉴于慢性病毒性肝炎与肝癌的密切关系以及垂盆草在治疗慢性病毒性肝炎中的疗效，本实验采用垂盆草醇提物对肝癌细胞HepG2进行干预，结果显示CCW可明显阻止细胞进入G2/M 期，使其停留在静止期，抑制HepG2的生长。AE.CCW作用质量浓度分别为0、25、50、100、200 gml-1时VEGF的表达;FJ.CCW作用质量浓度分别为0、25、50、100、200 gml-1时cMyc的表达图3 免疫细胞化学检测HepG2细胞VEGF和cMyc蛋白的表达 200Fig 3 Immunocytochemical detection of VEGF and cMyc in HepG2 cells (200)cMyc作为一种广泛存在的转录调节因子参与了许多基因表达的调控，与细胞的增殖、生长、分化、凋亡、新陈代谢以及肿瘤的形成有密切的关系18。该基因位于染色体8q24 上，一方面通过染色体易位与免疫球蛋白轻链序列融合而被激活，另一方面通过DNA 扩增导致功能失常，其编码的蛋白质能与核内的DNA 特异结合行使转录调节功能。cMyc在细胞静止期不表达，而在有丝分裂原作用下迅速表达，促使细胞增殖、浸润，最终使细胞增殖异常而癌变。过度表达的cMyc原癌基因在肿瘤细胞周期调控中扮演着重要的角色19。它能导致CDK抑制因子(KIP1)从原本无活性的cyclin ECDK2KIP1复合体中解离出来，使此复合物被磷酸化而获得活性，促进细胞从G0/G1期向S期进行20。本实验研究了HepG2细胞cMyc mRNA转录水平及蛋白翻译水平的改变，结果显示经CCW处理48 h后的HepG2细胞cMyc的表达明显下降，说明CCW能抑制cMyc的表达，而细胞周期调控蛋白被认为是cMyc重要的下游效应器，所以我们推测CCW对HepG2细胞增殖活性的影响可能与下调cMyc表达密切相关。此外，血管生成在肝癌的生长、浸润以及转移过程中发挥着重要的作用，新生的血管不仅能提供给肿瘤生长所需的营养成分，而且提供了肿瘤细胞扩散的途径21，其中VEGF是一高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素，它通过旁分泌方式作用于血管内皮细胞，促进内皮细胞增殖和迁移，诱导新生血管的生成。已有研究发现，实体瘤的发生、发展分为无血管期和血管期，无血管期的肿瘤直径不超过2 mm22，瘤体的营养由血液中氧气和营养物质通过弥散作用供给，此期的肿瘤无诱导血管生成的能力，不会发生转移。进入血管期后，肿瘤细胞分泌大量VEGF等血管生长因子，诱导新生血管生成，导致瘤细胞迅速增殖，发生浸润和转移。本实验通过检测经不同浓度CCW处理后HepG2细胞中VEGF基因及蛋白表达量的变化，发现随着药物浓度的增加，HepG2细胞VEGF的阳性表达率有显著的下降。说明CCW能有效抑制HepG2细胞分泌VEGF，为垂盆草在体外的抗血管生成作用提供一定的实验依据。总之，垂盆草醇提物能抑制HepG2细胞增殖，并阻滞细胞于G0/G1期，这可能与它能降低cMyc的蛋白表达有关系。另外，垂盆草醇提物能有效抑制HepG2细胞分泌VEGF，具有一定的抗血管生成作用。本实验结果为垂盆草应用范围的拓展提供了一定的实验依据。【参考文献】 1国家药典委员会.中国药典M.5版.北京:化学工业出版社,2005:149.2PERZ J,ARMSTRONG G,FARRINGTON L,et al.The contributions of hepatitis B virus and hepatitis C virus infections to cirrhosis and primary liver cancer worldwideJ.Hepatol,2006,45(4):529538.3曹基辉,张静,翟成凯,等.乙型肝炎病毒X基因与肝细胞肝癌J.东南大学学报：医学版,2003,22(3):195198.4KIM M H.Flavonoids inhibit VEGF/bFGFinduced angiogenesis in vitro by 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