STR发展及应用.ppt

STR及其法医学应用,蔡福营 2007.2.8,一、 STR研究发展过程,人类基因组遗传标记发展过程,第一代遗传标记 RFLP 第二代遗传标记STR 第三代遗传标记SNP,用于个体识别的遗传标记的发展,1985,1990,1994,1996,1998,2000,2002,1992,Capillary electrophoresis of STRs first described,First STRs developed,FSS Quadruplex,First commercial fluorescent STR multiplexes,CODIS loci defined,STR typing with CE is fairly routine,Identifiler 5-dye kit and ABI 3100,PCR developed,PowerPlex 16 (16 loci in single amp),2006: DNA is an important part of the criminal justice system,2004,2006,Y-STRs, Justice for All Act ($1B over 5 years),Multiplex STRs,mtDNA,法医领域STR发展前景,/nij/pubs-sum/183697.htm,美国国家司法局（national institute of justice）调研报告2000年11月份 评估DNA证据在未来 2, 5, and 10 years的发展前景 结论 STR typing is here to stay for a few years because of DNA databases that have grown to contain millions of profiles,法医学遗传标记的发展方向,提供更多信息的STR检测试剂盒（新的位点和其它生物学特征） miniSTR（迷你STR，长度较短，100bp左右） SNP（与个体特征相关如肤色、毛发等的单核苷酸多态性位点）,二、 STR生物学特征,STR，short tandem repeat,短串联重复序列，微卫星（microsatellite），SSR (simple sequence repeat) 结构特征：序列重复，分为简单重复（simple）和复杂重复（complex） 分布于基因之间 STR基因座命名原则,STR是重复单位长度为2-6核苷酸的重复DNA序列,Dinucleotide (CA)(CA)(CA)(CA) Trinucleotide (GCC)(GCC)(GCC) Tetranucleotide (AATG)(AATG)(AATG) Pentanucleotide (AGAAA)(AGAAA) Hexanucleotide (AGTACA)(AGTACA),These categories were first described by Urquhart et al. (1994) Int. J. Legal Med. 107:13-20,STR 重复复杂程度分类,STR在人类基因组中分布广泛,HGP带来更多STR认识 目前被鉴定出的4核苷酸重复超过20，000个(Collins et al. An exhaustive DNA micro-satellite map of the human genome using high performance computing. Genomics 2003;82:10-19) 整个基因组中STR数量可能超过100万！ (Ellegren H. Microsatellites: simple sequences with complex evolution. Nature Rev Genet 2004;5:435-445). STR占整个人类基因组序列的3 (Lander et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature 2001;409:860-921).,STR命名原则,国际法医血液遗传学会（International Society of Forensic Haemogenetics, ISFH）1994,1997年提出命名原则 DNA链的选择（编码区和非编码区） 主型选定和等位基因命名,5-GGTTATTATTATGG-3 5-GGTTATTATTATGG-3 ,经典STR检测分析方法,设计位点特异性的引物，用PCR方法扩增得到STR片段 电泳检测扩增产物长度，并与allelic ladder对比 检测方法：PAGE（银染）荧光标记（测序仪、遗传分析仪）,基于STR长度不同来分辨,Multiplex PCR 多重/复合PCR,复合扩增的优势： 一次反应获得更多信息量 降低成本，减少工作量，提高效率 模板需求量低,在同一反应体系中加入两对或更多引物，同时扩增得到,复合扩增的难点： 多对引物相互作用 反应条件一致 非特异性产物,荧光标记的分析方法,毛细管电泳图谱,三、STR分型中经常遇到的现象,Stutter 影子带 不依赖模板的加A作用 Off ladder的微变化等位基因 三等位基因（Tri-allele） 无效等位基因（Null alleles） 遗传突变（Mutation）,影子带 stutter,通常比主带少一个重复单位，由于滑动复制引起（也可以见到多一个） 重复单位越大，stutter越低（2345） 重复长度越长，stutter越高 Stutter产量依次减小（主带12） 导致混合样本分型困难,影子带的产生(图片改为gene8),True allele (tetranucleotide repeat),n-4 stutter product,n+4 stutter product,Insertion caused by slippage of the copying (top) strand,Repeat unit bulges out when strand breathing occurs during replication,Deletion caused by slippage on the copied (bottom) strand,Occurs less frequently (typically 2%) often down in the “noise” depending on sensitivity,Typically 5-15% of true allele in tetranucleotide repeats STR loci,不依赖模板的加A作用,Taq polymerase具有不依赖于模板在扩增产物的3末端加一个核苷酸（通常是A）的性质。具有高保真性的Taq酶例外。 反向引物的5端如果是G，可以增加加A的效率，也可以添加一个6核苷酸的tail PCR反应程序最后60度或72度保温1545分钟 酶活力不够，可能导致加A效率低，出现双峰现象，（如：过量模板可能导致，体系中含有反应抑制物等）,5末端核苷酸对加A效率的影响,Promega includes an ATT sequence on the 5-end of many of their unlabeled PP16 primers to promote adenylation see Krenke et al. (2002) J. Forensic Sci. 47(4): 773-785 /biotech/strbase/PP16primers.htm,Figure 6.5, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition 2005 Elsevier Academic Press,过量模板可能导致加A不完全,Microvariant off ladder现象,重复次数不是基本重复单位的整倍数 或者序列跟基本重复单位不同或者这两者同时存在 非整倍重复的等位基因命名方法：完整重复数点部分重复数 (Bar et al. Int. J. Legal Med. 1994, 107:159-160) 例子: TH01 9.3 allele: TCAT4 -CAT TCAT5,三等位基因（Three-Peak Patterns）,类型2,三个峰高度相似,主要发生于TPOX and D21S11,类型1,两个峰高度之和与第三个峰高相同,D18S51,主要发生于D18S51,TPOX,Clayton et al. (2004) A genetic basis for anomalous band patterns encountered during DNA STR profiling. J Forensic Sci. 49(6):1207-1214,1137号样本GE16A检测结果,STRBase中的微变化和三基因案例,Off-Ladder Alleles,Tri-Allelic Patterns,/biotech/strbase/var_tab.htm,Currently 328 at 13/13 CODIS loci + F13A01, FES/FPS, Penta D, Penta E, D2S1338, D19S433,Currently 80 at 13/13 CODIS loci + FES/FPS,Null alleles（无效等位基因）,样本DNA中含有该等位基因，但是由于没有被扩增和检测到，由于引物结合部位发生突变导致。 能够导致杂合子表现为纯合子，影响了DNA数据库比对 不同引物体系检测同一样本可能得到不同结果 新的STR检测试剂盒在应用之前需要与已有产品进行大量的比对试验 Goldeneye16A 与Identifiler和PowerPlex16 比对目前没有发现这一现象,*,*,8,8,6,6,8,Allele 6 amplicon has “dropped out”,Imbalance in allele peak heights,Heterozygous alleles are well balanced,引物结合部位发生突变对扩增的影响,没有突变,结合位点3端突变 (allele dropout),结合位点中部突变,Butler, J.M. (2005) Forensic DNA Typing, 2nd Edition, Figure 6.9, Elsevier Academic Press,遗传突变 mutaiton,无突变时遗传规律,父系突变,图谱为某市公安局06Q248号亲子鉴定三联体样本D8S1179位点,父,母,子,等位基因由亲代向子代遗传过程中不遵循孟德尔遗传定律,突变特点,突变普遍存在，发生在生殖细胞减数分裂过程中 突变率通常为1/1000减数分裂 父系突变通常高于母系突变 VWA, FGA, and D18S51突变率最高 TH01, TPOX, and D16S539突变率最低,商业化STR分型产品,ABI公司（美国），国内市场占有85左右，国际？ Promega公司（美国），国内市场占有15左右 其他外国公司（德国、澳大利亚） 公安部第二研究所（物证鉴定中心） 江西中德生物 珠海科登（codon）?,目前研发的公司和机构,13个CODIS核心 STR Loci 及其染色体定位,CSF1PO,D5S818,D21S11,TH01,TPOX,D13S317,D7S820,D16S539,D18S51,D8S1179,D3S1358,FGA,VWA,AMEL,AMEL,主流产品STR位点比较,11 CODIS(TH01TPOX),Amel,D2,P E,D6,ABI ID,PP16 GE16A,DNA Typer15,11 CODIS(TH01TPOX),Amel,D2,D19,D6,D12,ABI China,Goldeneye 16A,FAM,HEX,TMR,Promega PP16 kit,FAM,JOE,TMR,D5 155-205,D13 205-250,D7 251-300,D16 260-300,CSF 300-350,D2 305-370,FGA 210-360,D8 120-180,D12 215-275,A,Vwa 151-215,D3 100-150,D6 120-200,D21 185-250,D18 280-360,D19 100-150,ABI China kit,FAM,NED,VIC,JOE,DNA Typer15,D5 120-165,D13 155-190,D7 240-280,D16 255-300,FGA 330-400,CSF