实验性腹膜炎小鼠脾、肾钙调神经磷酸酶的变化.doc

实验性腹膜炎小鼠脾、肾钙调神经磷酸酶的变化 作者：程建青 李海峰 范红斌 杜斌 杨志勇【摘要】 目的： 观察实验性腹膜炎小鼠脾、肾钙调神经磷酸酶(CaN)在腹膜炎病程中变化。方法：36只小鼠随机分为6组，即腹膜炎48h、5d、10d、14d、21d组与对照组，腹膜炎组腹腔注射1%冰醋酸0.2mL，对照组腹腔注射等量生理盐水，每组各6只。采用比色法测定脾、肾组织CaN活性。结果： 脾CaN活性在实验性腹膜炎5d、10d、14d、21d呈持续性低水平（P<0.01）；肾CaN活性在实验性腹膜炎10d达高峰14d、21d与10d相比呈下降趋势但仍高于对照组，差异有显著性。结论： 实验性腹膜炎小鼠脾、肾CaN活性变化与病程进展有关。 【关键词】 腹膜炎;脾;肾;钙调神经磷酸酶 【ABSTRACT】 Objective:AIM To investigate the alteration of calcineurin activity in spleen and kidney in experimental peritonitis mice.Methods:36 Kunming mice were randomly divided into 6 groups，which were experimental Peritonitis groups for 48h、5d、10d、14d、21d and control group.In the groups of experimental peritonitis,the model of nonspecific peritonitis was induced by injecting ice acetate acid into mouses peritoneal cavity,and the same quatity of normal saline was injected to animals in control group.CaN activity in spleen and kidney was measured by using PNPP as substrate.Results:CaN activity in spleen was significantly decreased in experimental peritonitis groups of 5d、10d、14d、21d compared with that of control group（P<0.01）,while in kidney was increased for the groups of 10d、14d、21d（ P<0.01or P<0.05） compared with that of control group.There was a peak time at 10d.Conclusion:CaN activity might be involved in functional regulation for spleen and kidney in experimental Peritonitis. 【KEY WORDS】 Peritonitis;Spleen;Kidney;CaN 钙调神经磷酸酶(calcineurin,CaN)是迄今发现的唯一受Ca2+/钙调素(calmodulin,CaM)调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶,参与了多种生理功能调节1。既往发现CaN在淋巴细胞的活化和神经系统中发挥重要作用2,CaN活性改变与多种疾病发生发展密切相关，本研究对实验性腹膜炎小鼠脾、肾CaN活性变化进行研究，为研究腹膜炎自愈过程中机体损伤和抗损伤机理提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 动物分组及模型制备 选用健康昆明种小鼠36只，体重1822g，由浙江实验动物中心提供。在标准饲养条件下，小鼠随机分为6组，即腹膜炎48h、5d、10d、14d、21d与对照组，腹膜炎组腹腔注射1%冰醋酸0.2mL，对照组腹腔注射等量生理盐水，每组各6只。 1.2 酶活性测定 无机磷法测定CaN活性，以每小时每毫克蛋白的CaN分解底物对硝基苯磷酸(PNPP)产生1molL-1无机磷的量为一个活力单位（molPi/mgprot/hour）。考马斯亮蓝法测定组织蛋白含量。测定试剂购自南京建成生物工程研究所，按试剂盒说明制备脾、肾组织样本,操作按照说明书进行酶测定，考马斯亮蓝法测定组织蛋白。 1.3 统计学分析 运用 SPSS12.0 统计软件对数据进行统计处理。实验数据以平均值标准差（x)表示，样本均数间比较采用单因素方差分析。 2 结果 小鼠腹腔解剖观察 实验组小鼠腹腔注射冰醋酸后，精神萎糜，进食减少。腹腔解剖，48h有腹膜和肠管壁充血、水肿，胃肠扩张明显，有腹水。5d的小鼠，腹腔仍有充血，但充血减轻，水肿减轻，渗出的腹水被吸收，肝脏与膈肌之间及部分小肠之间粘连。注射10d后的小鼠腹腔中的渗出液体已大部分被吸收，肠管色泽恢复，有轻微充血和肠管壁轻微水肿的情况，仍有脏器的粘连情况。注射冰醋酸14d后的小鼠腹腔中渗出的液体已吸收，肠管壁的水肿不明显，充血减轻。21天小鼠腹腔观察已基本恢复正常，与空白对照组比较无明显区别。 脾、肾CaN活性在实验性腹膜炎48h无显著性变化；脾的CaN活性在腹膜炎5d、10d、14d、21d组呈持续性低水平（P<0.01）(图1)；肾CaN活性在实验性腹膜炎5d、10d 逐渐上升，10d达高峰（P<0.01），14d、21d与10d相比呈下降趋势但仍高于对照组，差异有显著性（P<0.05）(图2)。各组小鼠脾、肾CaN的活性变化见表1。表1 不同组别小鼠脾、肾钙调神经磷酸酶活性比较注:*与对照组比较P<0.05，*与对照组比较P<0.01 3 讨论 机体局部病变可引发全身各器官发生相应的反应。本研究采用比色法，对实验性腹膜炎小鼠脾、肾CaN活性进行测定，发现实验性腹膜炎小鼠CaN活性在脾、肾调控变化不同。与对照组相比,脾CaN活性在实验性腹膜炎5d、10d、14d、21d均呈显著性降低。肾CaN活性在实验性腹膜炎从5d升高，10d达高峰14d、21d仍高于对照组，差异有显著性。以往研究显示，CaN具有广泛的组织分布，在神经组织和T淋巴细胞中含量最为丰富，其中脑的CaN占脑总蛋白含量1%以上，在心脏和骨骼肌中亦有较高的表达，在肺、脾、肾和肝组织中也同样存在。CaN不同的组织分布特性，表明其具有广泛的组织生物学效应3。CaN的组织生物学效应是通过CaN活化达到的。有研究发现，正常Wistar大鼠CaN活化强弱特征表现为:脾、肾、肝、脑、肺、主动脉和心，其中以脾CaN活性最强，心脏CaN活性最弱4。然而，当受外源性醛固酮处理4周后，Wistar大鼠CaN活化特性发生了明显的变化，表现为:心、肺、脾和脑CaN活性明显增高，其中心脏上升了147%、肺95%、脾65%、脑43%。本研究显示小鼠脾CaN活性高于肾脏，实验性腹膜炎自愈过程中，脾和肾的CaN活性变化不同。对肾性高血压大鼠重要脏器CaN活性变化的研究发现，假手术组大鼠脾中CaN活性甚高，认为可能是外伤性刺激对假手术组大鼠脾脏组织中的CaN高表达造成了一定的影响5。而本研究中腹膜炎521dCaN活性呈持续性低水平，表明腹膜炎损伤与外伤性刺激脾的反应机理不同。肾内CaN活性变化，证实在实验性腹膜炎过程中肾组织有反应性变化，但在21d时CaN活性仍高于正常对照组，提示腹膜炎损伤自愈过程在细胞水平的恢复较腹腔观察征象可能更长一些时间。肾CaN活性增强可能是细胞内钙大量内流激活的结果，而脾的CaN活性下降可能来源于某种内源性抑制因子。脾和肾在已有的研究资料中是含有CaN活性较高的器官，研究病理状态下脾和肾CaN活性变化，对探讨重要脏器结构与功能保护具有重要意义。本研究结果提示实验性腹膜炎小鼠脾、肾CaN活性变化与病程进展有关。有关小鼠腹膜炎CaN活性在脾、肾调控变化的不同机理有待进一步研究。【参考文献】 1 Gurerini D.Calcineurin:not just a simple protein phosphataseJ.Biochem Biophys Res Commun,1997,235(2):2712752 Yakel JL.Calcineurin regulation of synepic function:from ion channels to transmitter release and gene transcriptionJ.Trends Pharmacol Sci,1997,18(4):1241333 Liu J.FK506 and cyclosporin,molecular probes for