早期巨噬细胞激活和核因子κB活性在深低温停循环肺损伤中的作用.doc

早期巨噬细胞激活和核因子-B活性在深低温停循环肺损伤中的作用 作者：高波涛，郑景浩，徐志伟，刘锦芬，苏肇伉，丁文祥【摘要】 目的 探讨早期巨噬细胞的激活和核因子kappa B (NF-B)活性在深低温停循环(DHCA)肺损伤中的作用及其可能的作用机制。方法 通过DHCA幼猪模型的建立，采用免疫组化和ELISA方法，检测缺血再灌注不同时段肺组织巨噬细胞的激活、NF-B的表达以及炎性因子含量的变化来检验巨噬细胞激活和NF-B活性在DHCA肺损伤中的作用。结果 NF-B表达和炎性因子含量的变化与DHCA缺血-再灌注呈时间依赖性，且在DHCA缺血-再灌注1.5 h时NF-B的表达达到高峰，此时肺组织的炎性细胞以巨噬细胞为主。结论 早期巨噬细胞的激活和NF-B活性可能加重DHCA肺损伤的发生。 【关键词】 核因子kappa B;深低温停循环;再灌注损伤Abstract: OBJECTIVE To explore the role of early activity of macrophages and nuclear factor-kappa B(NF-B) in deep hypothermia and circulatory arrest (DHCA) and also evaluates their possible effective mechanism.METHODS Twelve piggies were randomly divided into two groups. There were six piggies in each group，normal temperature cardiopulmonary bypass(CPB) and DHCA. Lung tissue and venous blood samples were collected from every pig to meassure the virances of NF-B by immunohistochemistry and inflammatorys factor by ELISA at the six scheduled different time.RESULTS The expression of NF-B and changes of inflammatory factor has correlation with time of ischemia reperfusion and reached their peak at 25 hours after ischemia reperfusion. Macrophages were the most abundant cells in pulmonary inflammatory cells. CONCLUSION The early activity of macrophage and NF-B may play an important role in lung injury of DHCA.Key words： Nuclear factor- kappa B; Deep hypothermia and circulatory arrest; Reperfusion injury深低温停循环(deep hypothermia and circulatory arrest，DHCA)是新生儿和婴幼儿复杂先天性心脏病手术中常用的一种体外循环(cardiopulmonary bypass, CPB)技术，急性肺损伤是这些患者术后的重要并发症和死亡原因之一，然而其发生机制尚不十分清楚。我们通过建立DHCA模型，来探讨早期巨噬细胞的激活和核因子kappa B(NF-B)活性在DHCA肺损伤中的作用及其可能的作用机制。1 材料与方法1.1 实验模型的建立 健康幼猪12只，雌雄不限，体重(10.21.6)kg，2周龄，随机分为两组：对照组(常温并行循环组，n=6)和实验组(停循环组，n=6)。均常规行右房以及升主动脉插管，建立CPB。对照组并行循环180 min;实验组并行循环30 min后将体温降至22，然后停循环1 h，之后再灌注1.5 h。1.2 标本采集 两组分别于并行循环前(T0)、并行循环30 min(T1)、90 min(停循环1 h,T2)、120 min(再灌注0.5 h，T3)、150 min(再灌注1 h，T4)、180 min(再灌注1.5 h，T5)6个时间点留取肺组织标本，用4%甲醛固定，以备做免疫组化定性测量NF-B(Lab Vision公司，美国)，同时抽取静脉血标本以备用。参照试剂盒(Sigma公司，美国)操作说明采用ELISA法测定肿瘤坏死因子-(TNF-)、白介素(IL)-8和IL-6含量。1.2 实验方法 采用免疫组织化学法检测NF-B(P65)的表达。取用4%甲醛固定新鲜肺组织标本，石蜡包埋标准切片后，二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水;3%过氧化氢阻断内源性过氧化酶;0.01 mol Tris-EDTA微波修复;非免疫性动物血清封闭非特异性抗原;NF-B(P65)一抗(1100稀释)，4孵育过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次，每次5 min;之后加辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，37孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min; 3,3-二氨基联苯胺(DAB)显色，苏木精复染，盐酸酒精分化，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片，观察结果。 每张切片在高倍镜下选择5个视野，记数每100个细胞中阳性细胞个数，取其平均值作为该标本的NF-B染色阳性率。NF-B细胞阳性率以-(阴性，为未见阳性细胞)、+(弱阳性，为阳性率<25%)、+(阳性，为阳性率25%60%)、+(强阳性，为阳性率>60%)4个等级表示。1.3 统计学分析 所有数据均以SPSS 11.5软件进行统计，实验数据以均数标准差(s)来表示，采用方差分析对其进行组内及组间的比较，P<0.05为差异有统计学意义。2 结 果2.1 肺组织免疫组化 T0时实验组和对照组肺组织标本NF-B均为阴性，胞核未见棕染,T1时均为弱阳性，可见少量巨噬细胞及淋巴细胞胞核棕染,两时间点组间差异均无统计学意义(P>0.05);对照组T2、T3、T4、T5时肺组织标本仍为弱阳性，组内差异无统计学意义(P>0.05)，见图16;而实验组在T2时肺组织标本为弱阳性，与CPB前组内比较差异无统计学意义(P>0.05),T3时肺组织标本为强阳性, 可见大量巨噬细胞及淋巴细胞胞核棕染,组间及组内差异均有统计学意义(P<0.05),T4时肺组织标本仍为强阳性, 组间差异有统计学意义(P<0.05),组内差异无统计学意义(P>0.05)，T5时肺组织标本为阳性, 可见较多的巨噬细胞及淋巴细胞胞核棕染,组内及组间差异均有统计学意义(P<0.05),见图712。2.2 炎性因子组内比较 对照组TNF-、IL-8、IL-6 CPB前与CPB后差异有统计学意义(P<0.05)，CPB后各时段之间差异无统计学意义(P>0.05);在实验组，随着缺血-再灌注时间的推移，上述炎性因子的含量逐渐增加，与CPB前以及再灌注之前差异有统计学意义(P<0.05)，但同缺血-再灌注之前相比较，TNF-含量在缺血-再灌注1h时差异有统计学意义(P<0.05)，后两种炎性因子含量的差异则在缺血-再灌注1.5 h时有统计学意义(P<0.05)。2.3 炎性因子组间比较 T0时实验组和对照组血浆中均有少量IL-6和IL-8以及TNF-，T1时三者在两组中均出现了明显升高(P<0.05);此后，三者在对照组中含量逐渐上升直到T5亦未出现明显升高(P>0.05)，而在实验组，血浆中TNF-、IL-6和IL-8的含量在T1后逐渐升高，在T4时血浆中TNF-的含量出现了明显升高(P<0.05)，此时，IL-6和IL-8的含量尚未出现明显升高(P<0.05)，在T5时IL-6和IL-8的含量则出现了明显升高(P<0.05)。见图1316。注： 与组内T0比较P<0.05，与组内T1比较P<0.05，与同一时段组间比较P<0.053 讨 论DHCA肺损伤的发生是中性粒细胞依赖性的，其发生依赖于如下机制1： 缺血再灌注损伤导致活性氧和炎性分子(特别是细胞因子)进入循环2; 白细胞、血小板、补体、凝血系统的激活，以及其他可能继发于血液与CPB管道接触的炎性因子的释放3-5; 术中及术后内脏血流灌注相对不足，可能导致肠壁缺血、毛细血管通透性增加，致使肠内菌群异位进入循环。有研究提示肺泡巨噬细胞在氧化应激诱导的肺缺血-再灌注损伤模型中，对于细胞因子和趋化因子的产生以及继发的肺损伤的发生中起着中枢作用6，并且可以通过抑制NF-B活性来减轻巨噬细胞所致的缺血-再灌注肺损伤7-9。但是，目前对于早期巨噬细胞的激活和NF-B活性在DHCA肺损伤中的作用及其可能的作用机制少见报道。NF-B是一种普遍存在的转录因子， 其广泛存在于细胞胞浆中，是许多促炎细胞因子(包括TNF-、IL-6、IL-8)、炎性介质、黏附分子和急性期反应蛋白高表达所必须的转录因子，被认为在急性炎症发生发展中起着相当重要的调控作用10。研究表明CPB能使得炎性因子TNF-、IL-8、IL-6在血浆以及支气管肺泡灌洗液中的含量增加11，致炎细胞因子TNF-、IL-8、IL-6对多种器官包括肺均有损害12。其中TNF-在肺损伤中发挥中枢作用，已在多种急性肺损伤模型中得到证实13-15，进一步的研究表明肺泡巨噬细胞是其来源，其通过旁分泌和自分泌的方式刺激内皮细胞、上皮细胞以及间质细胞，最终导致炎性细胞的聚集和组织损伤的发生16。我们研究发现在DHCA再灌注0.5 h内，NF-B的表达达到了高峰，同时肺泡内出现了大量的巨噬细胞聚集，随后NF-B的表达下降，血浆中TNF-的水平在再灌注1 h时出现了高峰，随后IL-6、IL-8的表达开始出现明显升高。这种实验结果提示我们，DHCA再灌注早期肺损伤发生的可能机制为：缺血-再灌注时活性氧等氧化应激促使肺泡巨噬细胞NF-B活性上调，使得巨噬细胞迅速表达TNF-，随后再导致其它炎性介质的释放、各种细胞的激活，最终导致中性粒细胞的大量聚集并释放蛋白酶等毒性物质，导致肺损伤的发生。因此，我们的实验表明早期巨噬细胞的激活和NF-B活性在DHCA肺损伤的发生中起着重要作用，以巨噬细胞和NF-B为靶目标的治疗措施可能为DHCA肺保护提供新的治疗策略。【参考文献】 1 Levy JH,Tanaka KA. 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