磷脂在医药工业上的应用.doc

第七章 磷脂在医药工业中的应用第二节 药用脂质体三 磷脂作为药用脂质体的应用（三）药用脂质体的制备1天然药用脂质体1 胰岛素脂质体1脂质体组成：二棕榈酰磷脂酰胆碱，牛胰岛素，大豆卤醇，钙黄绿素制备方法：二棕榈酰磷脂酰胆碱和大豆卤醇（摩尔比为7：2）用Hepes缓冲液（20mml/L Hepes和150mmol/L Nacl，PH7.5）以反相蒸发法分别制备包封胰岛素，钙黄绿素的二棕榈酰磷脂酰胆碱/大豆卤醇脂质体2，并挤压通过孔径为20nm的聚碳酸脂膜以调节微粒。未包封的物质通过SephadexG100粒（1.526cm）以Hepes缓冲液（PH7.5）洗脱除去. 说明:1.胰岛素是一种有51个氨基酸的二链多肽,在维持体内血糖水平中起着重要作用.在胰岛素分子表面,同时有极性和非极性部分.胰岛素结构中有25%42%的-螺旋结构,因此胰岛素会和脂体膜相互作用. 2.经过测定,包封钙黄绿素和包封胰岛素质体的包封率(EE%)的实测值与例论值基本一致,说明钙黄素和胰岛素包封于脂质体内部,脂质体的粒径在170-190nm,粒径分布均匀. 根据通过Seephadex G-100柱前后的二棕榈酰胆碱（DPPC）与药物，以下式计算脂质体的包封率（EE%）： EE%实测=100（Da/Db）/（La/Lb） Da：通过Sephadex G-100柱分离后包封在脂质体内的药物量，Db为药物的投药量；La为通过Sephadex G-100柱分离后包封药物的DPPC量，Lb为DPPC的投入量。 EE%（理论）=（Vi/Vt）100 Vi是脂质体内部的体积，Vt是脂质体混悬液的总体积。 复方唐松草新碱多相脂质体3 4 脂质体组成：唐松草新碱，大豆磷脂，胆固醇，油酸，聚乙烯吡咯烷酮（PVP），非离子表面活性剂。制备方法：取唐松草新碱，大豆磷脂，胆固醇以及非离子表面活性剂在80oC左右熔融，然后加入相同温度的M/15磷酸盐缓冲液溶解的PVP中，高速搅拌即得。过滤，灌封于10ml安瓿中，用100oC流通蒸汽灭菌30分钟，放冷，剧烈振摇，使成均匀的多相脂质体混悬型静脉注射液即得。说明：1。唐松草新碱盐酸盐注射液为水溶液，制成脂质体后，剂量从原来水针剂的100mg/Kg减小到10mg/Kg，而对S18O的抑癌率却有原来25%提高到42.7%,说明剂型可提高疗效，减小毒性。2.处方中加入生物表面活性剂大豆磷脂，胆固醇，以及非离子表面活性剂等,减低双分子层的流动性,防止低分子药物渗出脂质体，保证药物的缓释作用，起到助悬作用，使剂型稳定。3.本制备方法采取熔融法,能经受100oC30分钟灭菌。灭菌后脂质体聚集与介质分离,但经振摇即可恢复分散性,简化分子筛分离步骤和溶媒.4.经过稳定性试验:粒度分布，加速试验(80 oC,8-10天)证明粒度随温度升高加大，仍属变化小,成品较稳定，25 oC贮存期为2.63年.5.安全试验:过敏刺激，溶血,热原毒性试验等，证明符合要求，进入临床使用。对S18O和胃癌有抑制作用。III 干扰素-脂质体5脂质体组成：干扰素-2a,大豆磷脂，胆固醇，十八胺,三羟甲基胺基甲烷，山梨醇.制备方法：采用粉末床研磨法制备前体脂质体。称取载体粉末，置于研钵中，脂质加入一定量的脂质乙醚溶液,研磨至乙醚挥干,真空干燥器中4 oC下放置过夜，通过100目的不锈钢筛网,即得类白色良好流动性的粉末状前体脂质体。加入适当的IFN-2a(干扰素-2a)的水溶液，以Ph7.4的Tris-HCL缓冲液定容,即得IFN-2a混悬液.说明: 干扰素-具有广泛的抗病毒,抗增殖和调节免疫机能等生物学活性.近年来在药物的靶向治疗中发现,脂质体包封药物后,可使药物分布于肝,脾,淋巴结等网状内皮系统,从而提高肝内药物浓度.2.本工艺制得的前体脂质体 水化性能良好,与IFN-水溶液混合即得IFN-脂质体,适合临床要求.3. IFN-前体脂质体的处方中,磷脂与胆固醇质量比为9:1,山梨醇为保护剂,保护剂与脂质的质量比为5:1,十八胺和脂质的质量比为1:9,制备的IFN-脂质体的平均粒径为80.836nm.4.包封率的测定:取未经分离和分离的IFN-脂质体,假加入TrionX-100,使浓度为2.0mg/ml,在4 oC静止1h,用ELISA试剂盒测定IFN-的浓度,其值为吸附在脂质体表面IFN-的浓度.包封率(%)=CL/CO100%CO:总的IFN-CL:脂质体中的IFN-经测定，本工艺制备的前体脂质体的包封率为59.03.3%.IV 油酸多相脂质体6脂质体组成:油酸、大豆磷脂、胆固醇、PVP、非离子表面活性剂.制备方法：取油酸、大豆磷脂、胆固醇以及非离子表面活性剂在80 oC左右熔融,然后加入同温度的M/15磷酸盐缓冲液溶解的PVP液中,高速搅拌即得.过滤，灌封于10ml安瓿中,用100 oC流通蒸汽灭菌30分钟,放冷,剧烈振摇,使成均匀的多相脂质体混悬型静脉注射液即得.说明：1.油酸经脉注射剂不具抗癌活性，必须包封成脂质体中才能发挥抗癌活性。晚期胃癌有效率为66.7，对肺癌也取得肯定疗效。2经稳定性试验，安全性试验和疗效试验均证明为生物利用度较高剂型。3处方中各组分在80熔融后，必须澄明溶液，特别是胆固醇结晶应完全融解，否则配液过滤时会阻塞沪器，使操作困难。若药物为强疏水性仍需先用少量有机试剂溶解后，再分散再熔融液中，然后蒸发除去有机溶剂再分散在缓冲液中，成为多相脂质体混悬型静脉注射液。4用激光散射法进行制剂稳定性和粒度分布的测定，粒度小于1.0um，80加热72小时，其粒度变化甚微，符合静脉要求。V阿昔洛韦棕榈酸脂质体7 脂质体组成，卵磷脂(PC)，胆固醇(CH)，胆固醇硫酸酯(CS)，棕榈酸(PA)，神经酰胺(CM)，阿昔洛韦棕榈酸脂(ACV-C16)。制备方法ACV-C16多室脂质体：用Bangham薄膜分散法，将按比例混合后的脂质体和处方量的ACV-C16溶于氯仿25ml，37充氮条件下旋转蒸发，除去氯仿，将制得干膜的烧瓶在真空状态下储存过夜，进一步除去有机溶媒，加入PBS缓冲液(PH7.4)，40涡旋振荡40min即得。ACV-C16大单室脂质体：用S20Ka改进逆相蒸发法，将按比例混合后的脂质膜材和处方量的ACV-C16溶于氯仿20ml，加入PBS(PH7.4)5ml，超声5min，形成稳定乳剂，充氮条件下45旋转蒸发去有机溶剂，达胶态后加适量PBS(PH7.4)，继续减压蒸发30min，以除去残余有机溶剂，即得脂质体/水性混悬液。ACV-C16脱水/水化脂质体，用Kirby方法，将按比例混合后的脂质膜材和处方量的ACV-C16溶于氯仿30ml，真空状态下旋转蒸发去有机溶剂，加入PBS(PH7.4)10ml，45涡旋振荡30min以充分水化。将制得的混悬液于旋转蒸发仪上50真空脱水，得粘稠状物质，加入PBS10ml(PH7.4)，再于4530min充分水化40min，即得。说明，1.阿昔洛韦是目前国内外广泛使用的具有高度选择性和较低毒性的第二代核苷类高效广谱抗病毒药物，临床上常用于治疗水痘，带状疱疹病毒和单纯性疱疹病毒HSV1和HSV2等引起的皮肤和 粘膜感染。2前体药物阿昔洛韦棕榈酸脂阿昔洛韦棕榈酸酯能够增加药物的脂溶性，将其制成皮肤用脂质体后，提高了阿昔洛韦脂质体中的包封率和皮肤内的滞留浓度，增强了药物的局部治疗作用。3制备的脂质体中含ACV-C16为0.5%，脂质材料20mg/ml的脂质体。以卵磷脂/胆固醇(PC/CH)为基本处方，分别加入CS(胆固醇硫酸酯)，PS(磷酸脂酰丝氨酸)制成荷正电荷的阳性脂质体，组分摩尔比均为1:0.5:0.1。同时根据人皮肤角质层的脂酯组成制备不含磷脂的皮肤脂质体8，处方为CM/CH/PA/CS，组成质量比为4:2.5:2.5:1。以上各脂质体处方中均加入1.5%的Vitc混合物(3:1)作为抗氧剂。4.经试验可以看出，脂质膜组成对脂质体稳定性的影响主要表现在两个方面(1)当脂质体膜表面电性与药物带电相反时，其包封率高，稳定性好。故带正电荷的ACV-C16在PC/CH/CS和PC/CH/PS等带负电的脂质体中的包封率荷稳定性高;(2)单一磷脂中加入胆固醇可改变相变温度，对脂质膜的流动性产生双向调节功能。在相变温度以上时，它能抑制脂质分子的旋转异构，降低膜的流动性;在相变温度以下时，它又能增加脂质双分子膜的不对称性，增加膜的流动。因此4时脂质体的渗透率低于25时的渗透率。 喜树碱多相脂质体9脂质体组成: 喜树碱，大豆磷脂，胆固醇，Tween80，Span80，PVP。制备方法:将喜树碱用少量10%NaOH加热溶解，稀盐酸调PH约9.0，用磷酸缓冲溶液(PH8)稀释至所需浓度，取PVP溶于磷酸缓冲溶液中，加热至70备用。大豆磷脂，Tween80在70下熔融，另取胆固醇， Span80在100以下熔融，熔化物合并，混均倒入有PVP的缓冲溶液中，高速搅拌，形成脂质体后，滤过灌封，100流通蒸汽灭菌30分钟。说明：1.喜树碱因对消化道毒性而很限制使用。作为脂质体后减低了毒性，并且对组织选择性分布中肺部浓度高于其他组织二倍。在体内滞留时间延长。因肺泡分泌出一种表面活性剂能均匀分布肺泡表面，主要成分为双软脂酰卵磷脂，它和构成脂质膜的磷脂结构相似，药物注射后，脂质体被机械滤取在肺表面，而构成膜磷脂成分与肺表面活性剂融合而滞留在肺组织，快且多，因为肺部对药物的吸收与脂溶性成正比，因此，口服药对消化系统的肿瘤治疗取得较好疗效，提高了组织利用度，而不增加药物对中枢神经系统毒性。2稳定性试验，粒度试验，灭菌前后几乎无变化，能耐受100，30分钟流通蒸汽灭菌，温室贮存140天后，颗粒无显著变化，99脂质体粒径在6um以下，符合静脉要求。3喜树碱多相脂质体的包封率为733.4。其包封渗透有温度和介质的碱性。温度升高，渗透加快，介质的碱性高也能加速漏出，存放中包封药物与游离药物达到平衡，不存在渗透问题，稀释后平衡破坏，药物从脂质体中渗透到脂质体外面，稀释倍数与渗透成正比。4抗肿瘤试验，毒性实验，一般安全试验（刺激性，过敏性，溶血性等实验），结果良好，无异常变化。脂质体显著增加ECA小鼠的存活时间，延长寿命50103，增强抗癌活性，毒性低.各组织对喜树碱的摄取率,平均较静脉注射喜树碱高.VII 葫芦素BE脂质体10脂质组成:葫芦素BE,大豆磷脂,胆固醇,油酸，混合表面活性剂.制备方法:去葫芦素5mg,大豆磷脂1g，胆固醇0.3g，油酸0.1g,混合表面活性剂0.5g，在80oC以下熔融制成透明溶液后,分散于同温度的0.067mol/L的磷酸盐缓冲液中,使总体积为50ml.说明:1.葫芦素有很强的生理活性,其片剂用于治疗病毒性肝炎，肝癌.2.经测定，葫芦素的包封率为41.82.2%.在100oC灭菌30分钟的脂质体，粒径小于1um,并且粒径分布集中。3.在葫芦素BE脂质体中，油酸和混合表面活性剂的存在影响脂质体和包封率，当去掉油酸和混合表面活性剂时,所形成的脂质体对葫芦素BE的包封率大大降低。并且该脂质体制备过程中，只有当油酸，胆固醇及混合表面活性剂三种组分的用量有一适宜的比例时,才能保证体系有最佳物理稳定性.4.按本工艺制备的脂质体无相分离温度；煮沸2小时（100oC）不分层，且粒径基本无变化；微粒荷负电荷，粒径在0.3-1um间.VIII 三尖杉酯碱人细胞膜脂质体11脂质体组成：结晶三尖杉酯碱(含量97%);人红细胞膜(磷脂酰胆碱PC:25.5%,磷脂酰丝氨酸PS和磷脂酰肌醇PI总量为16.2%,磷脂酰乙醇胺PE为19.0%,神经鞘磷脂SM为20.4%,胆固醇CH为18.9%).制备方法:用乙醚溶解一定量的膜脂,按有机相:水相=3:1之比加入15mg/ml的三尖杉酯枸橼水溶液，用旋转蒸发仪通氮除去乙醚，使膜脂成一薄膜,加水振摇,制成大单层脂质体，然后在超声波清洗器中水浴超声(4 oC),根据所要求脂质体的大小,决定超声时间，制得乳状态，在4 oC保存半年无分层现象。说明：1.用柱层析除去游离药,用sephadex G75柱分离重蒸水洗脱,紫外254nm检测,分离出游离药物峰和脂质体峰.经测定其包封量为17.99ug/umol,包裹率为21.5%,回收率99.78%2.85.2.所制备的脂质体粒径为0.05470.0184um.IX 何糖腺苷脂质体12脂质体的组成:何糖腺苷(Ara-A),卵磷脂,胆固醇，十八胺,磷脂酸。制备方法：将卵磷脂，胆固醇，十八胺加入适当有机溶剂溶解,在水浴上减压蒸发除去有机溶剂，是磷脂部分成膜贴与茄形瓶壁,加入何糖腺苷溶液及缓冲液,将膜洗下，经超声处理后置低温冰箱冰冻，然后取出融化,充分振摇即得脂质体，充氮罐封于安瓿.说明：1.何糖酰苷脂质体为治疗乙型肝炎药.制成脂质体后，能保护药物不被酶解,提高在肝中浓度，缓释,毒性小，副作用少。并且能够达到疗效提高的目的。2.本工艺制备的何糖酰苷脂质体包裹率在50%以上,回收率为99.11%.测定方法：何糖酰苷脂质体经适当稀释并溶解后,上样于sephadex G-50凝胶柱分离，用高效液相色谱仪测定包裹和游离的何糖酰苷的含量,包裹率计算如下:Ara-A=(1-Cs/C总)100%Cs:脂质体中游离的阿糖腺苷的浓度;C总:脂质体中阿糖腺苷的总浓度。3. 阿糖腺苷脂质体经10030分钟加热灭菌处理,无明显的包裹率变化,在4贮存7个月后的包裹率也无明显变化。4Ara-A脂质体经水适当稀释后,用2%NaCl作电解液，在库尔特计数器测定其分布，电子显微镜观察，脂质体基本呈球形，外壁为多层型，灭菌后无显著变化和差异，形态和粒度分布无明显改变。X阿霉素温度敏感脂质体13脂质体组成：阿霉素注射剂，磷脂胆碱二棕榈酰脂（DPPC）。制备方法：采用S20ka的逆相蒸发法（REV）14真空度、温度和旋转速度等本工艺特殊控制，制成脂质体。4避光保存。说明：1.用散射光强度(动力学光散射法)测粒径和分布,限度为3-5000nm,平均粒径850nm,标准偏差50nm.2.超速离心分离与sephadex 过滤测包封率,结果为37.79%和38.12%,T检验无显著差异.用Tris-HCL液稀释后在室温观察，5周内LADM不分层,也不泄露.3.LADM相变温度为41(具有明显相变温度).并证明在此温度的阿霉素释放量突然增加，约为包封率的84%(敏感温度控释),8小时内稀释200倍的LADM的释放量不随时间延长而增加.相变温度脂质体中的药物释放不仅与膜材和药物有关，也与脂质体表面曲率有关。4.肝动脉注射LADM体内控释及循环中药物动力学实验证明：肝脏加热到相变温度，可控制脂质体中包封药的释放。动物肝动脉注射后给药组肿瘤内药物浓度高于正常组织，但LAPM组远超过其他组，有效的一直肿瘤的生长及延长荷瘤动物的生命。5.阿霉素治疗白血病和实体肿瘤起重要作用，用脂质体作载体可增强抗肿瘤活力，而且改变了它的药代动力学和在体内的分布，从而减少它对心脏的毒性作用，扩大了治疗的范围。 斑螯素多相脂质体15 脂质体组成，斑螯素，大豆磷脂，胆固醇与油酸，TWEEN80，PVP等。制备方法：1.斑螯素提取与精制：取斑螯除去足翅研碎，加盐酸拌和均匀，充分润湿后置密闭容器34小时，加水浸渍24小时，压滤滤渣再次用盐酸浸取，合并滤液，静置过夜，倾取上层清夜，溶液抽滤后并入上清液中，以适量氯仿萃取23次，即得粒晶，丙酮再重结晶。2.脂质体注射液的制备：精密称取斑螯素0.125克，溶于适量氯仿中，依次加入大豆磷脂，胆固醇，油酸，溶解后过滤，少许氯仿洗涤，收集于圆底烧瓶中，减压浓缩，置真空干燥箱中24小时，加M/15磷酸缓冲液，浸泡膨胀34小时，在高速搅拌下缓缓滴加TWEEN-80及PVP溶液，补足磷酸缓冲溶液至全量，超声分散，时常抽样测定脂质体平均粒度，合格后通过过滤器灌封，流通蒸汽灭菌30分钟即得。 说明：1.斑螯素制成多相脂质体后，被嵌入磷脂双分子曾中间，提高药物在生物膜上的主动运转，以包饮作用方式为细胞所吞噬。由于癌细胞较正常细胞旺盛活跃，脂质体极易融合进癌细胞内，而且癌细胞中含有较正常细胞更多的磷酸脂与酰胺酶，通过酶解作用又能把大量的药物释放出来，并滞留于癌组织中，增加斑螯素的抗肝癌效果，减少刺激性和毒副作用，小剂量即达高疗效。 2.非离子表面活性剂TW80作增溶剂，能把未包药物形成胶束而增溶，将未乳化油滴变成O/W与W/O/W微乳。 蟾酥脂质体1617. 丹参酮前脂质体18 脂质体组成：丹参酮粉末，大豆磷脂，胆固醇，聚乙烯吡咯烷酮（PVP），蔗糖。 制备方法：将精确称取的丹参酮，大豆磷脂和胆固醇共同溶于氯仿中，过滤，滤液收集于圆底烧瓶中，旋转蒸发挥去氯仿成薄膜，真空干燥后，加入PH=6.8的磷酸盐缓冲液，浸泡34H，然后在氮气保护下高速搅拌，制得丹参酮脂质体混悬液。 将上述混悬液，采用喷雾干燥法，进风温度为120，进料速度50ml/min,旋风分离器压差50mmH2O,100ml,雾化盘转速2500r/min。滤膜过滤，滤液在氮气保护下罐封，即得丹参酮脂质体。 将丹参酮前脂质体粉末加入蒸馏水中，室温下振摇，即得重建型脂质体。 说明：1.丹参酮为药丹参中的脂溶性有效成分，不仅具有天然抗氧化性，心血管药理作用以及抗菌消炎作用，还具有明显的抗肿瘤作用。制成脂质体后，改善了其在体内吸收效果差的缺点。 2.采用LS230型粒度仪检测脂质体的粒度分布。测得喷干前的原脂质体的平均粒度为0.200um，95%小于0.534m而其前体脂质体极为相似，平均粒度为0.211m，95%小于0.745m，比原脂质体略大。 3.喷干前后的丹参酮乙醇溶液的吸光度均在0.385-0.391之间，说明丹参酮在喷干过程中，浓度未发生明显变化，未发生明显的氧化和水解，表现出较好的稳定性。：青蒿脂质体19 采用乳化法制备多相青蒿酯脂质体，探讨其制备工艺，荷电性，胆固醇含量及附加剂对青蒿酯脂质体包裹率的影响。结果表明，带正电荷的脂质体其包裹率明显高于中性或带负电荷的脂质体，而类脂中胆固醇含量及附加剂对包裹率均无明显影响，最佳处方组成的包裹率为13.630.09%。采用冷冻干燥技术可获得稳定性较好的脂质体冻干品，而其结构和粒径均无明显变化，采用微孔膜压滤法，能有效的除去94%以上的游离药物。 用反相HPLC测定青蒿酯脂质体含量的方法，该法准确灵敏专一性和重现性均良好对比青蒿酯与青蒿素酯脂质体在动物体内抗原作用。结果表明，后者对鼠疟原虫的抑制率明显高于前者。 ：贵臼毒素二棕榈酰磷脂酰胆碱脂质体20 脂质体组成：大豆卵磷脂，鬼臼毒素，L-DPPC 制备方法：精密称取鬼臼毒素25mg,DPPC100mg,胆固醇25mg，加入500ml圆底烧瓶中，以二氯甲烷溶解，置于旋转蒸发仪上，真空条件下蒸溶剂，温度为45，转速100r/min,旋转至二氯甲烷挥发干净，瓶壁上形成一薄曾脂质膜，加入PH7.4PBS液5ml，超声水浴20min，将瓶壁上的脂膜洗脱，得到乳白色的鬼臼素DPPC脂质体混悬液。精密称取鬼臼素25mg，大豆卵磷脂167 mg，胆固醇42 mg，同法可制得淡黄色的鬼臼毒素大豆卵磷脂脂质体混悬液，两种脂质体混悬液中鬼臼毒素的浓度相同，为0.5%。 说明：1.鬼臼毒素是足叶草的主要有效成分，是治疗尖锐湿疣广为推荐的外用药物，常用的是0.5%的鬼臼毒素酊剂。脂质体是最近研究较多的新型控缓释药物载体，将鬼臼毒素制成脂质体制剂后，会在一定程度上改善鬼臼毒素的药代动力学和药效学，对尖锐湿疣的抗复发治疗有更好的疗效。 2.以10 mg鬼臼毒素配制标准液，在荧光分光光度计上绘制出标准曲线。取DPPC脂质体及大豆卵磷脂脂质体混悬液各0.5ml,加入0.5ml鱼精蛋白，再加入4mlPBS液，3000r/min,20min离心沉淀脂质体，取上清液用于测定游离药物的含量。取少量2种含药脂质体，加入少许异丙酸破坏脂质体膜，加适量PBS液稀释至标准曲线范围，用于测定总的药物浓度。根据标准曲线测定游离及总的药物浓度，根据公式：包封率=（总的药物浓度-游离药物浓度）/总的药物浓度100%。计算DPPC脂质体的包封率为71.6%，大豆卵磷脂脂质体的包封率为81.3%。 3.将 鬼臼毒素脂质体放置4冰箱中，3个月及6个月包封率无明显下降，此制剂比较稳定。 4.鬼臼毒素DPPC脂质体外用后，在皮肤局部先出现一个药物高峰，然后缓慢释放，药物浓度高于鬼臼毒素大豆卵磷脂脂质体，且在皮肤中存留时间长，鬼臼毒素经皮吸收并不增加，鬼臼毒素DPPC脂质体的皮肤靶向性比大豆卵磷脂脂质体更好。 XVI：大黄素纳米脂质体30 脂质体组成：胆固醇，磷脂，大黄素，葡萄糖等。 制备方法：精密称取处方量的大黄素，胆固醇，磷脂与250ml圆底烧瓶中，加氯仿20ml溶解，于旋转蒸发仪上减压蒸去氯仿。加入60g/l葡萄糖液10ml得脂质体粗混悬液，冷水浴超声2次，每次1min,0.8um微孔滤膜过滤，得到脂质体胶体溶液。 说明：1.大黄素纳米脂质体处方为：大黄素1.0mg,磷脂12.5mg,胆固醇12.5mg.2.大黄素纳米脂质体为浅黄色透明胶体，在透射电镜下，呈完整圆球形或椭圆形的球粒，粒径教均匀，约为25nm.2.合成药物脂质体1环孢素柔性脂质体21脂质体的组成：环孢素A，大豆磷脂，胆酸钠等。制备方法：定量称取大豆磷脂（5.5%），胆酸钠（1.5%）和环孢素（3.75%）置梨形瓶中，加入氯仿甲醇（1:1）使溶，减压蒸发除去溶剂，使磷脂等在瓶壁形成均匀的薄膜。然后在烧瓶中加入0.9%氯化钠水溶液10ml，振摇分散即得柔性脂质体粗混悬液。按相同比例制备处方中不含胆酸钠的普通脂质体粗混悬液。将上述两种粗混悬液在冰水条件下探针式超声5min可得到纳米脂质体胶体溶液。根据文献22报道，混合胶团的制备方法与脂质体相似，只需将柔性脂质体组分中的胆酸钠用量增加至2.5%，旋转蒸发后水合即可制得透明的磷脂胆酸钠混合胶团溶液。说明：1、环孢素有强亲脂性。高分子量以及环状结构，因此经皮转运非常困难，即使转运至真皮以治疗银屑病也未取得令人满意的结果。而制成柔性纳米脂质体后，柔性纳米脂质体有变形性23，在皮肤内水合力作用下能变形而产生穿透作用。在体实验与离体实验相比，药物的透过速度显著提高。表明皮肤在正常生理状态下得以保持完整的水分浓度梯度，自然存在的水合压力保证了柔性纳米脂质体以变形促渗机理为主较快速地透过皮肤。1、 应用Zetamaster光子相关光谱仪测得柔性纳米脂质体的平均粒径为(73.563.62)nm，普通纳米脂质体的平均粒径为63.894.75nm，胶团的平均粒径为15.322.34nm。采用微孔滤膜过滤法23测得柔性纳米脂质体和普通纳米脂质体的包封率分别为96.60%0.18%和98.91%0.08%。3、柔性纳米质体和混合胶团均有一定的促进渗透作用，在接收液及皮肤中检测到药物，在接受液中药物出现的时间分别为8和10h，载体促渗作用的大小与皮肤表面涂布的药液体积（或药量）有关，当柔性纳米脂质体中环孢素的浓度从3.43mgml-1增加至5.82mgml-1或者给药体积从20l增加至500l时，稳态透皮速率、皮肤药量亦相应增加。涂布普通脂质体30h后，接收液中未能检测到环孢素，但在皮肤中有大量环孢素的存在，达(3.430.79)gcm-1。4、 体皮肤渗透实验中，柔性纳米脂质体在内即携药透过小鼠皮肤进入血液循环，8h达到备药浓度峰值(1.4010.20)gml-1，24h备药浓度降至(0.0570.023)gml-1。AUC(10.680.76)ghml-1为，AUMC为(96.603.27)gh2ml-1，MRT为(9.070.37)h。普通纳米脂质体在血中几乎检测不到药物，混合胶团给药后0-24h之间血中也未检测到药物。环磷脂胺多相脂质体24脂质体组成处方环磷酰胺0.5%，猪苓多糖0.2%，Tween-80,prp,胆固醇，脑磷脂或卵磷脂适量。制备方法：将卵磷脂或脑磷脂按2%的量，再加胆固醇1%，包封于环磷酰胺和猪苓多糖制或脂质体中，经100流通蒸汽灭菌20分钟，显微镜下观合格，即得。脂质体组成处方25：环磷酰胺0.5%，大豆磷脂，胆固醇，VitE,人参多糖，非离子表面活性剂，冻于赋形剂（蔗糖，乳糖，甘露醇等。）制备方法：取大豆磷脂，胆固醇，VitE少许用乙醇溶解，人参多糖溶于磷酸缓冲溶液中（PH=6.65），将上述溶液混合，挥尽乙醇后置组织捣碎机搅拌10min，然后于10030分钟流通蒸汽灭菌，灭菌超大液超声210分钟，无菌条件下加入环磷酰胺，经最低共熔测定初步筛定的冻干赋形剂（蔗糖，乳糖）溶于甘露醇中，灌注入安瓶，无菌条件冷冻40小时干燥，界面整剂洁白，丰满。本品不能高温灭菌，否则抑瘤率失活并降低。说明：1。环磷酰胺易水解，不稳定，加热溶于水后分解为氮芥，是强烷化剂，应在到达靶区后生成，若到靶区产即形成，增加体内正常细胞的毒性，相反却降低对肿瘤的抑制作用，故临用新配。2处方中加入表面活性剂Tween80,span80，PVP适当比例混合共同存在，提高环脂酰胺的包封率及脂质体系的稳定性。较未加入的提高包封率67.1%，稳定性好，放置中虽有少量絮凝，再分散性很好，因为表面活性剂形成胶束，PVP可增加分散体系的粘度之故。且具保护作用，使药物毒性降低。无表面活性剂的产品，放置过程中颜色逐渐加深，沉淀不易再分散。猪苓多糖（免疫增强剂）的加入，能增强环磷酰胺抑肿瘤活性和稳定性，且本品优于去苓多糖。对S180小鼠抑瘤率由原来的29.9%增加到50.1%。处方中加入人参多糖效果更佳。3处方中环磷酰胺脂体包封率在50%以上，制备过程中药物水解程度小，损失重为4.34%。显微镜分光图象仪观察，处方中制备的环磷酰胺脂质体，平均粒径0.689m，其LD50及对抑瘤效果观察S180，EAC,CL三个瘤株抑癌实验结果显示，降低了对环磷酰胺的毒性，提高其抑瘤率。对肺癌，肝癌的治疗效果较佳。氟尿嘧啶脂质体26脂质体组成：5-氟尿嘧啶(5FU)，大豆磷脂，胆固醇，VitE,VitC.制备方法：反相蒸发制备脂质体。根据文献27取适量磷脂，胆固醇和VitE和VitC共溶于有机溶剂氯仿中，将药物缓冲液加到氯仿混合液中，超声形成均匀反相乳（反相乳为油包水型，与通常所指的水包油型乳相反）置于250ml茄形瓶中，减压挥干反相乳中的有机溶剂，至最终形成脂质体。说明：1。经多次实验，确定本工艺脂质体的最佳处方组成为10.0mgVitE,22.0mgVitC：缓冲液PH值8.0,5-FU的质量浓度8.0gl-1。测定出用均匀设计方法得出的优化条件制备的5-FU脂质体的包封率为32.110.23%(n=5)。高于各处方包封率。2用激光散射法制定所制备脂质体的粒径，可见5-FU脂质体的粒长在0.75m左右呈均匀的正态分布，75%的粒子粒径在1m以下，50%粒子粒径范围在0.8m以下。粒子分布范围符合静脉注射剂的要求。3通过对制备的脂质体的酸值测定，在不同的温度(4-40)下和光照(4500500)lx条件下，5-FU脂质体制剂的酸值变化都呈上升趋势。但在低温时，制剂的酸值变化不大，而在高温和光照时，制剂的酸值变化很大。说明5-FU脂质体在低温、避光条件下贮存，能较长时间保持稳定。4在不同温度(4-40)和光照(4500500)lx测定5-FU脂质体的过氧化值。其过氧化值变化随温度升高呈上升趋势。但在低温时，制剂的过氧化值变化不大；而在高温和光照时，制剂的过氧化值变化很大。在低温时保存可以稳定2年。.5-氟隶嘧啶脱氧核苷（3,5-二辛酰基氟苷,5-FUdR）28脂质体组成：3,5-二辛酰基氟苷,(Do-FudR),卵磷脂，三硬脂酸甘油脂，PluronicF-68,Pluronic,F-127,Tween80,Tween20,Dextran70,聚乙烯醇，猪胆盐，十二烷磺酸钠制备方法：称取Do-FUdR，卵磷脂和三硬脂酸甘油脂适量，溶于适量二氯甲烷中，减压旋转薄膜蒸发除去二氯甲烷，使溶质在瓶壁形成一层均匀的脂质薄膜，然后加入适量PluronicF-68水溶液，探头式超声波分散3min，即得药脂质体。说明：1。5-FUdR为嘧啶类抗代谢药物，属细胞周期特异性抗肿瘤药，其对肿瘤细胞的抑制作用取决于它与肿瘤细胞的接触时间。由于水溶性较强，在体内半衰期短，限制了药理作用的充分发挥。合成前体药物Do-FUdR，并制成药脂质体后，降低单核吞噬系统(MPS)的摄取，延长药物在循环系统的半衰期及药物与靶组织的接触时间29。2脂质体的制备采用中心组合设计优化薄膜超声分散法。粒径分布用激光粒度分析仪测定。取Do-FUdR脂质体胶体溶液，滴至专用铜网上，2.0%磷钨酸染色，在透射电子显微镜下观察，制得的脂质体呈良好的分散状态，表面光滑圆整，无不规则形状。平均粒径为69.12nm9.72nm。3药脂质体系中Do-FUdR的含量用高效液相法测定。色谱柱：ShimpackCLC-ODSC18柱，流动相：甲醇：磷酸盐缓冲液(PH:4.0=75:25)，检测波长265nm，流速1.0mlmin-1，柱温30。测定药脂质体的包封率为91.852.65%，载药量22.400.65%。氨甲蝶呤多相脂质体3132脂质体的组成：氨甲蝶呤，豆磷脂，胆固醇，非离子表面活性剂。制备方法：采用二次乳化蒸发法制备说明：1。氨甲蝶呤是目前用于治疗急性白血病的首要药物，疗效肯定，但对消化道和骨髓有毒副作用。脂质体显著提高对EC和L615小鼠的生命延长率，使药物在血浆中维持较高的浓度和时间。在肝脏的分布较低，在脾、肺、骨髓中药量较高，亚急性毒性试验表明氨甲蝶呤多相脂质体大剂量，出现肝变性环死。安全性实验未见异常反应。2多相脂质体能增强氨甲蝶呤化学稳定性，避光条件下的脂质体注射液，25贮存期为4.2年，PH7的磷酸盐缓冲液中的氨甲蝶呤，在避光条件下是以新的途径降解，说明磷酸盐对MTX的降解反应有特殊的催化作用在高温或多相脂质体中的氨甲蝶呤，能防止该反应的发生。氨甲蝶呤在4-25有新的降解物生成，其速度随温度升高而加快，但在60以上，反应不发生，此时氨甲蝶呤是按10-甲基叶酸的途径降解。化学动力学研究均在60以上高温进行，但未见新降解物生成。选用50mmol/l磷酸盐缓冲液作分散介质，卵磷脂/胆固醇/十八胺=7:2:1的摩尔比组成，是对热稳定的系统。3包封率和渗漏测定：用新建立的葡聚糖凝胶微柱型荧光法，测得结果表明，MTX多相脂质体的包封率为22%，由脂质体内向外渗漏，不被脂质体摄取，渗漏原因是由于脂质最后达到平衡，还可用纸层法测定包封率。卵磷脂的质量与氨甲蝶呤脂质的包封率有密切关系。卵磷脂放置过程中发生水解，氧化指数升高。氨甲蝶呤的包封率随氧化指数升高而降低，指数在0.2以下碘价在60左右的卵磷脂，制备氨甲蝶呤脂质体有较高的包封率。33脂质体组成：来氟米特，大豆磷脂，维生素E，胆固醇制备方法：称取处方量的大豆磷脂，胆固醇，维生素E等辅料溶于乙醚中，待完全溶解，将药物溶于其中，制得类脂溶液，将类脂溶液置250ml磨中梨形烧瓶中，同时加入适量直径4mm玻璃小珠，将梨形烧瓶置于恒温水浴上用旋转蒸发仪在140rmin-1转速并减压条件下蒸除有机溶剂，使磷脂等成膜材料在烧瓶壁及玻璃小珠上形成均匀类脂薄膜，然后向烧瓶中充数分钟，使溶剂完全除去，再向烧瓶中加入适量水合介质，一定温度条件下用旋转蒸发仪转动洗膜，待形成的类脂薄膜水合成牛奶状脂质体混悬液，再将该脂质体混悬液超声分散至溶液由乳白色为半透明，即得旋转薄膜超声法制备的LFM脂质体。说明：1。来氟米特（LMT）是治疗活动性风湿关节炎的新药。该药在水中的溶解度很小，且溶液的稳定性易于受PH影响。2取上述制备的脂质体1ml于100ml量瓶中，加流动相，摇匀，取该稀释液1ml于10ml量瓶中，加入内标联苯酚贮备液0.2ml，用流动相稀释至刻度，摇匀，离心10分钟(10,000r/min)，取20l进样，计算来氟米特的浓度，平均为(3.09000.0057)mgml-1。3将上述脂质体混悬液，分别用普通生物显微镜，透射电镜进行观察，普通生物显微镜观察，脂质体轮廓清晰，呈圆球状囊形颗粒，为单室脂质体，透射电镜采用磷钨酸负染法进行，即取1滴待测脂质体混悬液滴于点滴反应瓷板的凹槽内，并将喷碳铜网放于试液上（膜面向下），1-2分钟取出铜网，用滤纸小片从铜网边缘吸干多余液体，按上述同样方法，将该铜网放在染液滴（4%磷钨酸溶液,PH=7.0）上约30秒，用滤纸小片从铜网边缘吸干多余染液，干燥，观察脂质体磷钨酸染色铜网，脂质体呈典型单室，其双分子膜规整，均一，连续，呈椭圆形微球体。4取上述脂质体，经0.5%吐温80水溶液稀释后，用BI-90动态激光散射粒度测定仪测定脂质体的粒径及分布，有效粒径为(1062)nm，平均粒径为93nm。并利用高效液相色谱测定来氟米特浓度，计算得来氟米特脂质体的包封率为69.20%。甲硝唑脂质体34水溶性药物以脂质体作为载体主要问题是药物包封量低，稳定性差，若在水溶性药物的结构上进行疏水修饰，可以解决以上问题，例如将甲硝唑水溶性药物修饰为其豆蔻酸酯如：脂质体制备：甲硝唑豆蔻酸酯的合成：将二氯亚砜与豆蔻按1.5:1mol比投料（苯为溶剂），在无水条件下反应减压蒸馏得豆蔻酰氯，在新蒸吡啶中将甲硝唑与所得酰氯按1:1mol投料缩合成酯。以薄层色谱监测反应进程，上硅胶柱，用氯仿：甲醇(9.5:0.5)浇脱，蒸除溶剂即得。脂质体制备：将甲硝唑溶于磷脂及磷胶盐缓冲液中，其豆蔻酸脂盐溶于脂质的氯仿混合液中，用反相蒸发法分别制成甲硝唑和其酸酯盐的脂质体，除去游离药物，以氯仿为溶媒UV法制二种脂质体除去游离药前，后的吸收度A前及A后，（甲硝唑320nm其豆蔻酸酯315nm），计算包封率(Ep%)=A前/A后100%，结果其豆蔻酸酯盐比甲硝唑高10倍以上，其渗漏速率低，从而提高稳定性显著。重组型脂质体，将甲硝唑其豆蔻酸盐和脂质体一起溶于氯仿，旋转蒸发制成干膜，充氮密闭于冰箱保存。同时加入一定体积的磷酸盐缓冲液，经超声分散又可形成均匀重组型脂质体，为解决脂质体载物稳定性问题提供有效途径。说明：体外抗阿米巴原虫试验，因甲硝唑脂质体渗漏速度快，无法得到一定包封量稳定的脂质体，将其配成水溶液，甲硝唑其豆蔻酸酯用注射用油，加入表面活性剂制成O/W乳剂，此两种不同剂型药物比较抗阿米巴原虫的试验结果抗原虫的剂量甲硝唑其豆蔻酸酯脂质体为甲硝唑游离药的1/2量，而脂质体又比乳剂的剂量低，且抗原虫效果显著提高。故水溶性药物经疏水修饰，为脂质载体药提供了一条理想的途径。磷脂替加氟缀合物35磷脂替加氟缀合物的制备：将1.0g替加氟(5.0mmol),0.7gNaHCO3,2.0ml(30mmol)氯乙醇及10ml乙腈的混合物，在80下搅拌12h，冷却得到室温，过滤，滤液在减压下旋转去掉溶剂（温度低于50），将残余物进行快速柱层柏得化合物中间体。将六乙基亚磷酰三胺0.55ml()2.1mmol溶于50ml无水苯中，加入碘0.025g(0.1mmol)，加热回流直到白色沉淀消失，加入0.48g(2mmol)上述中间体，在65下搅拌8h，加入0.71g(2.1mmol)3-十八烷基-1,2-丙二醇，搅拌5h，加入硫0.066g(2.1mmol)，搅拌0.5h,旋转蒸发去掉溶剂，将残余物进行快速柱层析分离，得环甘油磷脂替加氟缀合物。说明：1。替加氟是目前常用的化疗药物，对多种肿瘤均有良好的抑制作用，但其毒性大常引起患者的不良反应。制成磷脂替加氟缀合物后，通过小白鼠抗肿瘤实验，治疗后小白鼠的体重并未见降低，这从另一方面说明该缀合物的毒性并不太大。并且通过体外的初步实验，证明该缀合物具有一定的抗癌活性，多种肿瘤细胞的生长都受到抑制，但对正常细胞也有一定的抑制作用。全反式维甲酸立体稳定脂质体37脂质体组成：全反式维甲酸，卵磷脂，胆固醇，吐温80制备方法：以薄膜蒸发法结合汽冻干燥法制备维甲酸普通和立体稳定脂单体：将适量药物，磷脂，胆固醇，吐温80等依次溶于无水醇，经旋转蒸发仪真空抽干，置真空干燥器过夜，加入冻干保护剂的水溶液水合，预冻12h后，冷冻干燥，即得维酸脂质体粉针。说明：1。全反式维酸是一种多烯酸，可用作癌症的预防治疗。2包封率的测定采用葡聚糖凝胶SephadexG-50色谱法进行分离测定。经测定，包封率的平均值为98.1%0.1%。经激光粒径测定仪测定粒径大小及分布，普通脂质体的平均粒径为351.6nm，多分散性指数为0.275，立体稳定性脂质体的平均粒径为418.2nm，多分散性指数为0.250。立体稳定脂质体较普通脂质体粒径大，而多分散性指数较小，说明加入吐温80后，亲水性聚氧乙烯基均匀分布在脂质体表面，脂质体分子之间相互吸引，聚集的机会减少，物理稳定性好。3经2%的磷钨酸染色，用负染法在透射式电子显微镜下观察普通和立体稳定脂质体的内部结构，可见普通和立体稳定脂质体均为大单室囊泡结构。普通脂质体为一表面光滑的中空结构，立体稳定脂质体的表面有凹凸感，且粒径较普通脂质体大。立体稳定脂质体的外观近似于膨胀的脂质双层的形态，因此其粒径较普通脂质体大。4全反式维酸立体稳定脂质体的包封率较高，表明脂质双分子层可显著增溶疏水性维酸，使维酸通过脉管内给药成为可能，这将是解决维酸口服生物利用度低和耐药性的有效手段之一。X碘醚柳胺脂质体38脂质体组成：碘醚柳胺，卵磷脂，豆磷脂，胆固醇，聚乙烯吡咯烷酮（PVP）制备方法：碘醚柳胺共沉淀物(Raf-PVP)制备：将Raf（碘醚柳胺）与PVP质量比为1:5,1:8,1:10，的混合物分别溶于适量的无水乙醇，水浴加热缓缓除去溶剂呈透明状后真空干燥，研碎过80目筛，并将上述粉末加微量水湿润后进行光学显微镜观察。碘醚柳胺脂质体的制备：采用冷冻溶融法制备碘醚柳胺脂质体。工艺流程如下：Raf-PVP共沉淀物+卵磷脂或豆磷脂+胆固醇+无水乙醇水溶溶解真空制膜固化10min蒸馏水溶胀超声15min-40下冷冻48h室温下溶融。说明：1。经过筛选，当共沉物的比例为1:5时，镜下显示有较多结晶存在，1:8时结晶基本消失，1:10时完全消失，故以1:8比例为佳。2电镜下碘醚柳胺脂质体是以膜相与水相交替分布的多层脂质体为主，其大小不均，层数不一。将脂质体作适当稀释后，在离心式粒度分析仪上测定其粒径分布在100-600nm不等，豆磷脂脂质体较卵磷脂制备的脂质体颗粒大小均匀，多数集中在0.5m左右。3用卵磷脂和豆磷脂制备的碘醚柳胺脂质体包封率最高分别达58%和57.54%。用卵磷脂和豆磷脂制备的碘醚柳胺脂脂质体室温贮存下，包封率变化差异不显著，说明用豆磷脂替代卵磷脂制备碘醚柳胺脂质体是完全可行的。4据报道，按7.5mg/kg体重剂量口服碘醚柳胺纯粉治疗肝片吸虫病患羊，其驱虫效果为99.19%，按3mg/kg体重剂量经皮下注射碘醚柳胺注射液，其治愈率达100%39。而本试验在比口服剂量相对减少25倍，与碘醚柳胺注射液相比减少10倍剂量的情况下，仍了得了100%的驱杀效果。这是由于脂质体在体内代谢过程中具有网状内皮巨噬系统的趋向性，能把药物特异性地带入到靶部位肝脏，从而使药物在肝脏中的浓度明显高于其它器官，进而提高了药物的有效利用度。顺铂缓释多囊脂质体40脂质体的组成：顺铂(CDDP)，卵磷脂(EPC)，胆固醇(CH)，三油酸甘油酯(TO)，D(+)-无水葡萄糖。制备方法：按处方精确称取EPC,CH和TO等置于带螺旋盖的小玻璃瓶中，加入适量氯仿和乙醚使其完全溶解（油相），缓慢滴加1gl-1CDDP的5.0%葡萄糖溶液（水相），涡旋振荡并探针超声成初乳，取初乳1.0ml，用注射器快速注入含0.040moll-1辅助乳化剂的4.0%葡萄糖溶液（二水相）中，涡旋振荡成复乳，迅速把复乳转移到250ml的平底锥形瓶中，用氮气吹除有机溶剂，即得顺铂多囊脂质体混悬液。说明：1。顺铂属周期非特异性抗癌药，抗瘤谱较广，但在体内会很快和蛋白结合而失效，铂的半衰期很长，体内的毒性大，存在肾毒性，神经毒性，骨髓抑制和严重的胃肠道反应，因此临床应用受到限制。2顺铂多囊脂质体混悬液的制备处方经筛选为：TO的量为2mol，辅助膜稳定性的量为1.6mg，氯仿：乙醚=1:1，离心2500rmin-1,5min时，顺铂与磷脂比对脂质体包封率影响不大。处方EPC:CH:TO=45:4.5:2(mol比)时，包封率为(90.11.1)%。3用相差光学显微镜在放大倍数为1020时能看到一个大的脂质体中又分为很多小囊。多囊脂质体表面形态并不象单室脂质体那样圆整，放置后重新分散好，均匀度好。经测定，平均粒径为16.6m。粒径分布符合正态分布规律。4在此制备方法中，CDDP多囊脂质体的包封率大于80%，最高达到。而用相同处方组成按逆相蒸发法制备的传统的大单层脂质体的CDDP的包封率为24.9%。多囊脂质体的包封率是传统脂质体的包封率的4倍左右。多囊脂质体的体外释药实验显示，它的释药t1/2是大单层脂质体的释药t1/2的9.4倍，具有很好的缓冲作用。尼莫地平纳米脂质体41脂质体的组成：尼莫地平，蛋黄卵磷脂，吐温-80，胆固醇，去氧胆酯钠，甘露醇制备方法：乙醇滴入超声制备工艺：称取处方量的尼莫地平，蛋黄卵磷脂，胆固醇，去氧胆酸钠，吐温-80等溶于适量无水乙醇中，得类脂溶液，称取处方量的甘露醇，溶于规定体积的水合介质中，将类脂溶液慢慢滴入其中，边滴边轻摇，即得含乙醇浓度为10%的脂质体初悬液，置于水浴式超声仪中超声至半透明胶体溶液，过0.15m滤膜，置于-20冰箱中预冻12h，冷冻干燥，即得尼莫地平脂质体冻干粉。薄膜超声制备工艺：称取处方量的各成分（甘露醇除外），以适量乙醇溶解，转移至1000ml的茄形瓶中，37恒温水浴中，用旋转薄膜蒸发仪减压蒸馏除去乙醇，在瓶壁上形成均匀类脂薄膜