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组织金属蛋白酶及其抑制因子与肝纤维化【摘要】 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)是体内重要的水解酶之一，几乎能降解细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的所有成分;基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissue inhibitor of metalloproteinasas，TIMPs )是MMPs的内源性抑制系统。近年来发现，MMPs/TIMPs调节失衡与肝纤维化的关系密切，可从多方面影响肝纤维化的形成。通过干扰MMPs与TIMPs基因的表达，研究肝纤维化的发病机制和药物治疗是有希望的途径。 【关键词】 MMPs ;TIMPs; 肝纤维化肝纤维化是许多慢性肝病的共同病理过程，是细胞外基质(ECM)的合成与降解失衡，导致在细胞间质的过度沉积1-4 ，肝组织结构改建。许多细胞因子参与了这一过程，但是MMPs是最重要的一种5。MMPs几乎能降解细胞外基质(ECM) 的所有成分，而其天然抑制剂-基质金属蛋白酶抑制剂(TIMPs)能与MMPs成员结合成复合物抑制其活性6。二者的调节异常将引起ECM合成或降解的失衡，与各种器官纤维化疾病密切相关。研究发现，通过调节MMPs与TIMPs基因的表达来治疗肝纤维化是肝纤维化治疗的新途径。本文就MMPs/TIMPs与肝纤维化的关系及治疗前景作一综述。1 MMPs分类、功能、结构及活性的调控MMPs是一组基质金属蛋白酶。MMPs在肝内主要由肝星状细胞(HSC) 和 Kupffer细胞表达分泌，参与细胞外基质降解的一类锌-钙离子依赖的内源性蛋白水解酶家族，因其需要Ca2+、Zn2+等金属离子作为辅助因子而得名，是迄今为止发现的唯一能分解纤维类胶原的酶，几乎能降解除多糖以外的所有ECM成分，在生理病理过程中发挥着重要的作用。MMPs家族由24种成员组成，其中有23种存在于人体中。1. 1 MMPs 可被分成六类7 (1) 胶原酶类。主要包括MMP-1、MMP-8、MMP-13和MMP-18。它们能够降解间质胶原(、型胶原)，也能消化许多别的ECM及可溶性蛋白5。 MMP-1又称成纤维细胞型，是人类主要的间质胶原酶，结缔组织细胞、肝内HSC、肝细胞、枯否氏细胞均有分泌，分解底物为胶原蛋白 (>I>)。而MMP-13是鼠类主要的间质胶原酶。MMP-8又称中性粒细胞胶原酶，主要降解型胶原。(2) 明胶酶类(gelatinases)。包括MMP-2(明胶酶A)及MMP-9(明胶酶B)。它们可降解明胶(变性胶原)和、和型胶原、层粘连蛋白、蛋白聚糖等。MMP-2和胶原酶类以相似的方式可以降解I,和型胶原，但其活性较MMP-1弱8。(3) 基质分解素(strogylisin)。主要包括MMP-3、MMP-10和MMP-11，仅有MMP-3在肝脏中存在。底物广泛，包括蛋白多糖、层粘蛋白、纤维连接蛋白、型胶原、明胶等。MMP-3与MMP-10均有相似的结构及降解底物，但MMP-3蛋白水解的效率比MMP-10更高，除能降解ECM成分外，它还可激活多种MMPs的前酶原。MMP-11对ECM的降解能力较弱。(4)基质溶解因子(Matrilysins)。MMP-7及MMP-26归为此组。MMP-7又称Matrilysin 1，MMP-26又称matrilysin-2或endometase。在正常肝组织中，MMP-26仅在内皮细胞有少量表达。MMP-26能降解许多ECM成分，它大多被储存在细胞内9。(5)膜型金属蛋白酶MT-MMPs(Membrane-Type MMPs)。这一类特殊的蛋白酶，主要存在于细胞膜上，具有广泛的底物特异性。其中4个是型跨膜蛋白(MMP-14、15、16、24)，2个是GPI锚连蛋白(MMP-17及MMP-25)。除了MT14-MMP之外，其它均能激活MMP-2酶原，这些酶能降解许多ECM分子。MMP-14在肝脏主要表达于活化的HSC中，与TIMP-2、MMP-2共同调节胶原的代谢10。(6) 其它种类的MMPs。包括MMP-12、19、20、21、23、27和28。MMP-12主要在巨噬细胞中表达，对于巨噬细胞的迁移起重要作用。MMP-23主要在一些再生性的组织中表达。而MMP-28在角质细胞中可见，在机体中参与止血及伤口修复11。MMP-12及MMP-19和MMP-20的主要底物为弹力蛋白、明胶、层粘连蛋白和型胶原。1. 2 MMPs的调控 MMPs在机体内的表达，激活及其对底物的分解过程均受到严格的调控5，其调控包括酶基因表达水平，酶原激活程序以及酶活性抑制等3个方面12：(1)MMPs的表达水平的调控：正常成人组织大多数MMPs表达水平很低，但在各种炎症细胞因子、激素、生长因子、CD40等作用下不仅能促进或抑制 MMPs mRNA的转录，且能影响其半寿期。对MMPs表达起上调作用的有TNF-、IL-1 、血小板源性生长因子及成纤维细胞生长因子(FGF)等，起下调作用的有转化生长因子- (TGF-)、视黄酸、 血管紧张素和糖皮质激素等，增强和抑制因子都作用于MMPs基因的前肽区。(2)MMPs的活性水平的调控：MMPs均以酶原的形式分泌，活化后才具有降解细胞外基质的作用。活化方式有3种13，即逐级活化方式-由血清蛋白酶如纤维蛋白溶解酶，胰蛋白酶，糜蛋白酶，弹性蛋白酶或激肽酶等介导。纤维蛋白溶解酶是MMPs最强有力的生理性激活物14。MMPs的前肽结构被血清蛋白酶水解，酶活性中心暴露后，再被其它的蛋白水解酶(如其他MMPs)激活。体内最主要的MMPs激活系统是组织或血浆的纤溶酶原钎溶酶系统( t-PA )。此外，某些 MMPs 可相互激活5;膜型-MMPs激活-膜型-MMPs能活化其它MMPs;细胞内激活-细胞内激活的精确机制和对细胞外MMP s 活性的作用，目前仍不明了。(3)MMPs的活性抑制物：激活的MMP可被普通的蛋白酶清除剂抑制，如2-巨球蛋白，但主要被特异的TIMPs所抑制。2 TIMPs的分类、结构、功能及活性的调节MMPs的表达和活化并不一定代表最后对ECM降解能力。因体内还存在MMPs的特异的抑制剂-组织金属蛋白酶抑制物(TIMPs) 。这是一组具有抑制 MMPs功能的活性多肽，在 ECM代谢的调节中起着非常重要的作用。目前共发现有4种TIMPs5。根据其发现的先后顺序依次命名为TI MP- l、TI MP-2、TIMP-3和TIMP-4。TIMPs是一组低分子量的糖蛋白，广泛分布于组织和体液中，可由成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞等产生。其中TIMP- l、TI MP-2、TI MP-4为可溶性蛋白质分子;而TIMP-3是仅存在于ECM中、并与ECM紧密结合的不可溶性蛋白质分子15。TIMPs由各自独立的基因表达，但四者氨基酸序列具有部分同源性，且都可与特定的活性MMPs通过非共价键结合成1:1复合物，抑制后者对ECM的降解，这种非共价键结合在生理条件下是可逆的。在肝脏中主要由HSC表达TIMP-1、2、316。对肝纤维化的诊断，TIMP-1特异性和敏感性均明显高于TIMP-2。TIMP-1在肝脏由Kupffer细胞、HSC及肌纤维母细胞产生，以活化的HSC表达最强17，能被多种细胞因于诱导产生，是体内存在与作用最广泛的一种TIMPs。它能结合除14、19以外的所有MMPs而使其活性减弱，可有效地抑制除MMP-2和膜型MMP外的大多数MMPs，是MMP-9活性的特异性抑制剂。TGF-、IFN、TPA、IL-1、IL-10、IL-，NO、RA等能够诱导TIMP-1的基因表达18。TIMP-2是型胶原酶 MMP -2 的特异性抑制因子。TIMP- 2/MMP -2系统对型胶原的增生沉积和降解起着重要的调节作用。3 针对MMPs和TIMPs的抗肝纤维化策略肝硬化是肝脏实质性病变，不可逆转，而肝纤维化是可逆性病变。因此，研究肝纤维化发病机制，进而寻求阻断肝纤维化过程的有效方法，对控制肝病的进展，有着十分重要的意义。鉴于MMPs和TIMPs在肝纤维化发展中的不同作用，增加MMPs或减少TIMPs的合成与表达将是肝纤维化基因治疗的一条新思路。目前国内外有关抗肝纤维化的各种治疗手段大多是通过下调TIMP-1、2的表达来实现肝纤维化的逆转19,20。杨长青等21运用DNA重组技术构建可表达大鼠MMP-1基因和反义TIMP-1序列的真核表达质粒，将其导入免疫损伤性肝纤维化模型大鼠体内，观察MMP-1和反义TIMP-1重组表达质粒对实验动物肝纤维化的影响。结果显示MMP-1、反义TIMP-1表达质粒均可促进肝脏中I、 型胶原的降解;病理形态学显示MMP-1、反义TIMP-1 表达质粒均对肝纤维化有一定的逆转作用;以两种质粒的联合应用效果最好，单独使用反义TIMP-1表达质粒次之，单独使用MMP-1表达质粒作用有限。Parsons CJ 22等发现在CCl4持续损伤的情况下，应用人抗鼠TIMP-1抗体后胶原沉积减少，能有效地控制肝纤维化的发展。Liu WB等23,24选用TIMP-1为靶基因，将表达反义TIMP-1的重组质粒导人体外培养的HSC内及用猪血清诱导的肝纤维化大鼠体内，发现反义TIMP-1均被成功表达，TIMP-1的基因及蛋白表达水平明显下降，间质胶原酶的活性增加，I、型胶原沉积量减少。显示肝纤维化水平降低66%。Iimuro Y等为了研究人类基质金属蛋白酶-1 (MMP-1)传递的基因能否降解I型和型胶原的问题，利用腺病毒和MMP的重组体导入已造模成功的小鼠体内，发现纤维化显著的减弱25 。转化生长因子1 (transforming growth factor beta 1，TGF-1)为现知最强力的促肝纤维化因子。在肝纤维化启动、进展乃至肝硬化的形成中发挥核心作用，是激活HSC并促进其表达ECM的关键因素，除抑制间质胶原酶和基质溶解素的表达外，同时还具有促进TIMP-1和MMP-2的作用26。由于TGF-1在肝纤维化中的广泛作用，尤其是肝损伤后，肝HSC对 TGF-1的自分泌及旁分泌作用，使得阻断TGF-1的信号通路成为肝纤维化治疗的理想选择27。总之，随着研究的不断深入，人们逐步认识到MMPs/TIMPs在肝纤维化形成中的作用，故研制的药物如能抑制TIMPs活性/增强MMPs活性，或者抑制其上游信号通路间接抑制TIMPs促进MMPs的活性，从而抑制肝纤维化，就有可能减缓或阻断肝纤维化的进程。迄今为止，肝纤维化过程中，MMPs、TIMPs调控机制、细胞来源、ECM各种成分之间及其与细胞之间的相互关系等问题有待进一步研究。近年随着分子生物学进展，对MMPs、TIMPs的分子结构和基因调控有了一定的了解，对肝纤维化的发病机制研究及从基因水平治疗各种肝纤维化提供了新的途径。【参考文献】 1 Kumar M，Sarin SK.Is cirrhosis of the liver reversibleJ.Indian J Pediatr 2007,74(4)：393-399.2 Andrade ZA.Regression of hepatic fibrosis J.Rev Soc Bras Med Trop,2005,38 (5)：514520.3 Gressner OA，Weiskirchen R，Gressner AM.Evolving concepts of liver fibrogenesis 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