钙离子在C型钠尿肽抑制乙酰胆碱增强胃窦环行平滑肌收缩效应中的作用.doc

钙离子在C型钠尿肽抑制乙酰胆碱增强胃窦环行平滑肌收缩效应中的作用 作者：邢德刚 张燕 梁艳玲 杨红【摘要】 目的 探讨细胞内外钙离子在C型钠尿肽（CNP）对乙酰胆碱（Ach）引起的大鼠离体胃窦环行平滑肌收缩效应中的作用。方法 利用浴槽孵育离体大鼠胃窦环行肌肌条，用离体平滑肌张力记录装置记录平滑肌肌条收缩活动，观察钙离子对Ach引起的大鼠离体胃窦环行平滑肌收缩效应的影响。结果 CNP对Ach引起的胃平滑肌自发性收缩增强效应有明显的抑制作用，在用无钙灌流液灌流后，CNP仍能抑制Ach引起的收缩效应。而用胞内钙离子释放抑制剂(TMB8)后，CNP不能抑制Ach引起的收缩效应。结论 CNP抑制Ach引起的胃平滑肌自发性收缩增强效应与胞内钙释放有关。 【关键词】 钙离子；C型钠尿肽；乙酰胆碱；胃窦环行平滑肌近年研究发现，钠尿肽（NP） 3种受体NPRA、NPRB和NPRC在胃窦的黏膜和肌肉组织中都存在1，2，对胃肠吸收、分泌和肠动力等方面均有调节作用。众所周知，调节胃肠运动兴奋最主要的是胆碱能系统，那么NP在调节胃肠运动与胆碱能系统之间有怎样的关系尚未见报道。既往研究表明，C型钠尿肽(CNP)对胃平滑肌细胞的L型钙电流、自发瞬间外向钾电流、非选择性阳离子电流(Icch)均有一定作用35，其中Icch与胆碱能系统调节胃肠作用有着密切的关系，提示NP能影响胆碱能系统调节胃肠作用。笔者近期的研究发现，用胆碱能系统激动剂CarbAchol能明显增强胃平滑肌自发性收缩活动，这种兴奋作用可被CNP抑制，证明CNP与胆碱能系统在调节胃平滑肌自发性收缩活动中起相互拮抗作用，其作用机制与CNP改变胞内cGMP系统，进而影响Icch有关6。为进一步探讨CNP对胃肠运动的调节与胆碱能系统相互作用的机制，本实验观察细胞内外钙离子在CNP影响胆碱能系统效应中的作用。1 材料与方法1.1 实验动物选用体重200230 g的Wistar大鼠，雌雄不限，实验前禁食24 h，饮水不限。1.2 药品及溶液乙酰胆碱(Ach)、CNP、3，4，5Trimethoxybenzoic acid(TMB8)购自Sigma公司。重碳酸盐缓冲液成分(mmol/L)：NaCl 116、KCl 5.4、NaHCO3 24、NaH2PO3 1、MgC12 1、CaC12 2、葡萄糖5.6，用HCl将溶液调至pH7.35。1.3 制备胃窦环行肌条实验时猛击大鼠头部致昏，迅速取出其全胃。沿胃小弯打开胃，在Krebs液中漂洗干净。以黏膜面朝上将胃固定在蜡盘中，用小剪刀轻轻去除其黏膜层。平行于胃窦环形肌纤维走向切取肌条(10 mm1.5 mm)，将其固定于恒温灌流槽内(37)，用碳酸氢钠缓冲液连续灌流并通混合氧,利用生物信号处理系统记录胃窦平滑肌自发性收缩活动。1.4 Ach与CNP相互作用的测定用累积法描记胃窦肌条对Ach(110-8110-3 mol/L)的量效曲线及给予CNP(10-7 mol/L) 10 l再重复5HT量效曲线。1.5 胞内钙离子与Ach、CNP相互作用的关系测定肌条处于自然长度(不过度牵拉或松弛)，在重碳酸盐缓冲液孵育60 min左右，出现稳定的自发性收缩；以此为对照，将重碳酸盐缓冲液更换成无钙灌流液灌流，收缩稳定后，加入Ach 10-5mol/L，此时Ach所致的收缩是依赖细胞内Ca2的收缩，待收缩稳定10 min后，加入CNP 30 mol/L。1.6 胞外钙离子与Ach、CNP相互作用的关系测定标本在正常含钙灌流液中自发性收缩稳定后，加入胞内钙离子释放抑制剂TMB8 10 l(10-5 mol/L)作用10 min后，加入Ach 10-5mol/L。此时Ach所致的收缩是依赖细胞外Ca2的收缩，收缩稳定后加入CNP 30 mol/L。1.7 统计学方法所有统计数据用xs来表示,结果采用同体对照的t检验和组间对照的t检验。肌肉收缩幅度百分比=实验组收缩幅度/对照组收缩幅度100%。2 结 果2.1 CNP呈非竞争性拮抗Ach引起的胃窦肌条收缩量效曲线见图1。CNP使Ach量效曲线呈非平行右移 ，最大效应降低，抑制作用随剂量加大而增强，提示CNP呈非竞争性拮抗Ach引起的胃窦肌条收缩，用电脑作数据处理，得直线回归方程及相关系数r>0.93(P<0.01)，测得PD2为4.880.14。2.2 细胞内钙离子参与CNP对Ach的抑制作用在重碳酸盐缓冲液孵育60 min左右，出现稳定的自发性收缩；用无钙重碳酸盐缓冲液冲洗灌流后，收缩幅度明显降低，下降到（135）%；稳定10 min后，加入Ach (10-5 mol/L)，胃平滑肌收缩幅度明显提高，由（135）%增加到（938）%（.）；说明在细胞外无钙的条件下，ch仍可通过胞内钙释放引起胃平滑肌收缩。待收缩稳定10 s后，加入CNP(10-7mol/L)10 l，ch引起的收缩增强效应明显被抑制，收缩幅度降低到（214）%（.），表明细胞内钙离子释放参与了CNP对Ach引起的收缩增强效应的抑制作用。2.3 细胞外钙离子不参与CNP对Ach的抑制作用当用胞内钙离子释放抑制剂TMB8 10 l(10-5mol/L)作用10 min后，收缩幅度明显降低,下降到（346）%,加入Ach (10-5mol/L),收缩增加到（14811）%（.),此时Ach所致的收缩是依赖细胞外Ca2的收缩，加入CNP(10-7mol/L) 10 l,收缩幅度为（1398）%,CNP对Ach通过细胞外钙引起的收缩没有抑制,表明CNP对Ach的抑制作用不是通过胞外钙离子。3 讨 论 笔者以往的研究表明，CNP作为体内除NO外的另一个重要的非肾上腺素能、非胆碱能抑制性递质，可以通过细胞内cGMP信号系统，抑制Icch，参与胆碱能系统对胃肠运动的调节。现有资料表明，神经递质或激素等激动剂促进胃肠平滑肌细胞收缩，是由于激动剂使胞内肌浆网释放钙，或使胞膜钙通道打开而实现的7。Ach有打开钙通道的作用8，Hu等9研究发现，Ach与M3受体结合后，通过G蛋白耦联后开放Ca2+通道。在细胞外钙离子存在时，Ach不仅可激活平滑肌细胞钙通道从而促使细胞外钙内流；同时也能通过IP3途径促进胞内肌浆网释放钙10，引起平滑肌收缩。本文首先观察了胞内外钙在胆碱能系统引起胃平滑肌收缩效应中的作用，结果表明，用无钙灌流液冲洗灌流，同时加入胞内钙释放阻断剂TMB8后，Ach引起的收缩增强效应几乎被完全阻断，提示Ach对胃平滑肌收缩的效应依赖胞内外钙离子。那么钙离子是否也参与了CNP与Ach相互作用？本实验结果表明CNP能非竞争性抑制Ach引起的胃平滑肌收缩效应，在用无钙重碳酸盐缓冲液冲洗灌流后，Ach可通过胞内钙释放引起胃平滑肌收缩，这种收缩作用可被CNP拮抗；用含钙重碳酸盐缓冲液冲洗灌流，加入胞内钙释放阻断剂TMB8时，Ach可通过胞外钙进入胞内引起胃平滑肌收缩；此时加入CNP，Ach通过胞外钙引起的胃平滑肌收缩效应未受影响。本实验表明，CNP非竞争性抑制Ach引起的胃平滑肌收缩效应，是通过胞内钙释放途径实现的。笔者下一步工作是对CNP影响胞内钙释放机制进行更深入研究。【参考文献】 1 Chrisman TD，Schulz S，Potter LR,et al.Seminal plasma factors that cause large elevations in cellular cyclic GMP are Ctype natriuretic peptidesJ.J Biol Chem，1993；268(5)：3698703.2 ElGehani F，TenaSempere M，Ruskoaho H,et al.Natriuretic peptides stimulate steroidogenesis in the fetal rat testisJ.Biol Reprod,2001；65(2)：595600.3 Guo HS，Cui X，Cui YG,et al.Inhibitory effect of Ctype natriuretic peptide on spontaneous contraction in gastric antral circular smooth muscle of ratJ.Acta Pharmacol Sin,2003;24(10):10216.4 Guo HS，Cai ZX，Zheng HF,et al.Role of calciumactivated potassium currents in CNPinduced relaxation of gastric antral circular smooth muscle in guinea pigsJ.Acta Pharmacol Sin,2003；24(10):10216.5 Li Y，Xu WX，Li ZL.Effects of nitroprusside，3morpholinosydnonimine，and spermine on calciumsensitive potassium currents in gastric antral circular myocytes of guinea pigJ.Acta Pharmacol Sin,2000;21(6):5716.6 Xing DG,Huang X，Li CH,et al.Muscarinic activity modulated by Ctype natriuretic peptide in gastric smooth muscles of guineapig stomachJ. Regul Pept，2007;143：839.7 Olsson C，Holmgren S.The control of gut motilityJ.Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol,2001;128(3):481503.8 Grider JR，Makhlouf GM.Contract mediated by Ca2+ influx in longitudinal intestinal muscle cellsJ.J Pharmacol Exp,1988;244:4327.9 Hu J，Gao WY，Gao Y,et al.M3 muscarinic receptor and Ca(2+) influxmediated muscle contractions induced by crotonoil in isolated rabbit jejunumJ.J