《LCMS基础》PPT课件.ppt

液质联用技术简介 Introduction in the Application of Liquid Chromatography Mass Spectrometry,s1020429 张晶晶 s1020432 焦广睿,前言,输入文本内容,输入文本内容,输入文本内容,输入文本内容,液质联用技术简介,1,题目,题目,题目,题目,Click to add title,Click to add title,Click to add title,Click to add title,1,2,3,4,Contents,Add Your Text in here,Add Your Text in here,Add Your Text in here,Add Your Text in here,Add Your Text in here,图解,输入数字内容,内容,内容,内容,内容,题目,题目,题目,题目,色谱质谱的在线联用 将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来,色谱,质谱,实现对复杂 混合物更准 确的定量和 定性分析,LC-MS GC-MS,简化了样 品的前处 理过程,液质联用与 气质联用互 为补充，分 析不同性质 的化合物,LC-MS 的特长,MS,LC-MS,试样中的各成分根据固 定相（柱填料）对流动 相中组份保留能力的不 同，进行分离，根据成 分的性质采用UV、荧 光、电导等检测器。这 些检测器对物质的定性 主要根据保留时间，定 量根据峰强度和面积。 色谱仪在分离能力上优 越，但是，对多成分同 时分析有些成分几乎同 时从柱中洗脱的情况， 难于做到准确的定性、 定量。,将试样成分使用不同方 法进行离子化，根据所 得离子在真空中的质荷 比进行分离，是测定各 离子强度的高灵敏度检 测方法。所得的质谱由 于可表示某质荷比的离 子存在的程度，非常有 助于定性分析。质量数 在分子中是特有的信息， 而MS 可以直接取得这些 信息。但是，这是在单一 成分测定时的情况，而在 多数成分同时进样时极难 进行质谱的解析。,分离能力优越的LC 与定性能力优越的MS 相结合的装置，采用扫描测定所得的质谱,提供来自LC 洗脱成分中的分子量与结构信息，根据其他LC 检测器所得的保留时间对定性补充（图1）。另外，在SIM（选择离子监测）中利用质量数的高选择性有效的进行检测,即使LC 分离不充分，也可进行避开杂质影响进行定量分析。兼备分析对象和选择性好的特点。,LC,液质联用与气质联用的区别,气质联用仪(GC-MS)是最早商品化的联用仪器，它的优点受到广泛承认。在物质分离、定性这方面GC-MS 是有效的手段，但是，可分析的试样只限分析小分子、易 挥发、热稳定高、能气化的化合物；用电子轰击方式（EI）得到的谱图， 可与标准谱库对比。 也就是说LC-MS 具有分析试样的适用范围广的优点。 液质联用(LC-MS)主要可解决如下几方面的问题： 不挥发性化合物分 析测定； 极性化合物的分析测定； 热不稳定化合物的分析测定； 大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定； 没有商品化 的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。,现在，液相色谱质谱联用仪（LC-MS）已在制药、环境、食品、工业 材料等领域广泛使用。,LC-MS 的装置构成,质谱仪是由导入试样的HPLC 单元、LC与MS 的接口部分、试样离子化效导入生成离子的静电透镜部、将离子按质荷比m/z 分离的质谱分析部和检测被分离的离子的检测部构成。 根据离子化的不同有各种不同种类，这里展示采用一般LC-MS 检测器的大气压离子化四极杆MS 的构成（图2）。在大气压离子化部分包括电喷雾离子源（ESI）、大气压化学离子（APCI）等，起到与HPLC 接口和离子源的作用。这里产生的离子，脱溶剂后通过八极杆等聚焦，导入四极杆。在四极杆上加直流与高频交流电压，只让具有目标m/z 的离子通过。将到达检测器的离子流转化成信号，在PC 上读取。,HPLC部,PC部,检测器,大气压离子化,进行MS/MS的仪器从原理上分为两类,第一类仪器利用质谱在空间中的顺序，是由两台质谱仪串联组装而成。 即前面列出的串列式多级质谱仪。,第二类利用了一个质谱仪时间顺序上的离子储存能力，由具有储存离子 的分析器组成，如离子回旋共振仪（ICR）和离子阱质谱仪。但不能进 行母离子扫描或中性丢失。,仪器和工作原理简介,LC系统 接口和离子化方式 质量分析器 仪器的基本功能 离子极化方式 碰撞诱导裂解（CID） 扫描类型和扫描方式 LC-MS仪器组成框架图 真空系统 样品 液相色谱仪 接口 质量分析器 数据处理,LC系统,与传统的LC系统组成相同检测器 UV MS 色谱泵能在低流速下，提供流量准确、稳定的流动相 流动相不能含非挥发性盐类（如磷酸缓冲盐和离子对试剂） 流动相低浓度电解液和高比例有机相易获高离子化效率,接口和离子化方式,接口的作用 将流动相及其样品气化 分离出去大量的流动相分子 完成样品分子的电离 接口和离子化方式 接口的类型 传送带接口（MB） 粒子束接口（PB） 直接导入接口（DLI） 连续流动快原子轰击（CFFAB） 热喷雾接口（TSP） 大气压离子化接口（API） ） 大气压离子化接口（API） （1）电喷雾电离（ ESI） （2）大气压化学离子化（ APCI） ）,（1）电喷雾电离（EPI）,流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘； 气帘的作用：雾化；蒸发溶剂；阻止中性溶剂分子 特点 ： 通常小分子得到M+H+ 、M+Na+ 或M-H-单电荷离子测定混合物；最软的电离技术，通常只产生分子离子峰； 生物大分子产生多电荷离子，其易形成多电荷离子的特性可分析蛋白质和DNA等生物大分子； 通过调节离子源电压控制离子的碎裂（源内CID） 测定化合物结构。,大气压化学离子化（APCI）,样品液从由具有雾化气套管的毛细管端流出，经氮气流雾化， 通过加热管被气化 后经电晕尖端放电，溶剂分子被电离形成溶剂离子，然后雾化气和这些溶剂分子与气态样品分子反应，得到样品分子的准分子离子 特点 通常用于分析有一定挥发性的中等极性和弱极性 小分子化合物分析； 相较EPI对溶剂、流速和添加物的依赖性小； 适应高流量的梯度洗脱或高低水溶液变化的流动相； 通过调节离子源电压控制离子的碎裂（源内CID）测定化合物结构。,质量分析器,双聚焦扇形磁场-电场串联仪器(sector). 四极质谱仪(Q). 离子阱质谱仪（TRAP） 飞行时间质谱仪(TOF). (TOF) 傅里叶变换-离子回旋共振质谱仪(FT-ICRMS). 四极+TOF（Q-TOF） 串列式多级质谱仪三重四极（QqQ） (MS/MS) TOF+TOF,质量分析器,.四极杆质量分离器,质量分析器,1.四极杆质量分离器由四根平行的圆柱形电极组成，电极分两组，分别加上直流电和具有一定振幅和频率的交流电。当来自离子源的样品离子沿电极间轴向进入电场后，会在极性相反的电极间产生振荡。电极间轴向进入电场后，会在极性相反的电极间产生振荡。给定电压条件下，只有没m/z在某范围的离子沿间轴线做有限振幅的稳定的振荡运动 LC-MS (四极杆)联用仪器结构示意图,2.离子阱质量分析器,特定m/z离子在阱内一特定轨道上稳定旋转， 改变端电极电压，不同m/z离子端电极电压，不同离子飞出阱到达检测器,3.飞行时间质量分析器,-270v 负高压,2.8kv 负高压,抽真空,试样 离子流,接 收 器,漂移时间,质量分析器,4.串联四极质谱仪(MS/MS) 三重四极（QqQ） 离子源第一分析器 碰撞室 第二分析器接收器 MS1 MS2 Q1 Q2 Q3 优点：质谱的化学噪声降低， 较单级分析有更高专属性和 灵敏度； 缺点：质量范围及分辨率有限，不能进行高分辨测定。,二 仪器的基本功能 离子极化方式 碰撞诱导裂解（CID）质谱 扫描类型和扫描方式,离子极化方式 ESI中正、负离子方式： 中正离子溶液中预先形成的，酸性分子形成负离子，碱性分子形成正离子； 正离子检测方式下， 通常准分子离子以质子加合离子 或加合其他离子的形式存在。 离子极化方式 APCI中正离子方式： 中正离子方式 e + N2 N2+. + H2O H2O +. + H2O H3O+ + M APCI中负离子方式： 样品的准分子离子（M-H）-一般是OH-争夺 样品的准分子离子（ 一般是OH 质子而形成的 N2+. + e N2 + H2O +. H3O+ + HO. (M+H)+ + H2O,正、负离子模式的选择： 选择的一般原则为： ? 正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸 正离子模式： 对样品加以酸化。样品中含有仲氨或叔氨时可优 先考虑使用正离子模式。 ? 负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三乙 负离子模式： 胺对样品进行碱化。样品中含有较多的强伏电性 基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试使用负 离子模式。 碰撞诱导裂解（CID）谱 选择一定质量的离子作为母体离子进入碰撞室，室内 充有靶子反应气体，发生离子分子碰撞反应，从而 产生子离子，再经MS2的分析器及接受器得到子 离子质谱，称做CID (collision-induced dissociation)谱 碰撞气体：N2、He、Ar、Xe、CH4等 目的：裂解某一或某些特定的分子离子，给出其碎 片离子从而获得针对这一分子离子的结构信息,扫描类型和扫描方式,扫描类型： 全扫描（full scan） 提供样品中每个分析物的全部质谱 选择离子监测（SIM） 用于痕量分析，专属性远高于SIM 扫描方式： 子离子扫描（product ion scan） 母离子扫描（precursor ion scan） 中性丢失扫描（neutral loss scan）,LC-MS 分析条件的选择和优化,1.接口的选择,2.正、负离子模式的选择,3.流动相的选择,4.流量和色谱柱的选择,5.辅助气体流量和温度的选择,LC-MS 分析 条件的选择 和优化,LC-MS 分析条件的选择和优化,1.接口的选择： ESI 适合于中等极性到强极性的化合物分子，特别是那 些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子 （如蛋白质） APCI 不适合可带多个电荷的大分子，其优势在于弱极 性或中等极性的小分子的分析。 2.正、负离子模式的选择： 选择的一般原则为： 正离子模式：适合于碱性样品，可用乙酸或甲酸对样品加以酸化。样 品中含有仲氨或叔氨时可优先考虑使用正离子模式。 负离子模式：适合于酸性样品，可用氨水或三乙胺对样品进行碱化。 样品中含有较多的强伏电性基团，如含氯、含溴和多个羟基时可尝试 使用负离子模式。 3.流动相的选择 常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易 挥发盐的缓冲液，如甲酸铵、乙酸铵等，还可以加入易挥发酸碱如甲 酸、乙酸和氨水等调节 pH 值。 LCMS 接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含 钠和钾的成分必须lmmol/l。（盐分太高会抑制离子源的信号和堵 塞喷雾针及污染仪器） 含甲酸 （或乙酸） 2。 含三氟乙酸0.5。 含三乙胺l。含醋酸铵10 一 5 mmol/l。 送样前一定要摸好 LC 条件，能够基本分离，缓冲体系符合 MS 要求。,4.流量和色谱柱的选择 不加热 ESI 的最佳流速是 150ulmin，应用 4.6 mm 内径 LC 柱时 要求柱后分流，目前大多采用 l2.1 mm 内径的微柱，TIS 源最高允 许 lmlmin，建议使用 200400ulmin APCI 的最佳流速lmlmin，常规的直径 4.6mm 柱最合适。 为了提高分析效率，常采用 100 mm 的短柱（此时 UV 图上并不能 获得完全分离，由于质谱定量分析时使用 MRM 的功能，所以不要求各 组分没有完全分离）。这对于大批量定量分析可以节省大量的时间。 5.辅助气体流量和温度的选择 雾化气对流出液形成喷雾有影响，干燥气影响喷雾去溶剂效果，碰撞气影响二级质谱的产生。 操作中温度的选择和优化主要是指接口的干燥气体而言， 一般情况下 选择干燥气温度高于分析物的沸点 20 左右即可。对热不稳定性化 合物，要选用更低的温度以避免显著的分解。 选用干燥气温度和流量大小时还要考虑流动相的组成， 有机溶剂比例 高时可采用适当低的温度和流量小一点的。,样品的预处理,样品的预处理,从保护仪器角度出发,从 ESI 电离的过程分析,防止固体小颗粒堵塞进样管道和喷嘴，防止污染 仪器，降低分析背景，排除对分析结果的干扰。 要求获得最佳的分析结果,ESI 电荷是在液 滴的表面， 样品与杂质在液滴 表面存在竞争， 不挥发物（如磷酸盐等）防碍带 电液滴表面挥发，大量杂质防碍带电样品离子进 入气相状态， 增加电荷中和的可能。,样品的预处理,样品的预处理常用方法 a）超滤 b）溶剂萃取去盐 c）固相萃取 d）灌注（Perfusion）净化去盐 e）色谱分离 反相色谱分离 亲和技术分离 f）甲醇或乙腈沉淀蛋白 g）酸水解，酶解 h）衍生化 化合物鉴别 全扫描方式（Q1 扫描） 全扫描数据采集可以得到化合物的准分子离子， 从而可判断出化合 物的分子量， 用于鉴别是否有未知物， 并确认一些判断不清的化合物， 如合成化合物的质量及结构。 子离子分析（ MS/MS ） 子离子， 用于结构判断(得到化合物的二级谱图即碎片离子)和选 择离子对作多种反应监测（MRM）。 子离子谱图与锥体电压断裂谱图（源内 CID）可能十分相似，所不 同的是子离子质谱图已知只有一种质量通过 MS1，因此也已知所有碎 片离子都是由我们所选定的母离子所产生的，所以我们更相信由 MS/MS 产生的谱图的纯度。 用大气压电离质谱仪可以得到分子量信息,三 LC-MS技术在药物分析中的应用,药物代谢研究 天然产物天然药物的研究 中草药成分分析， 中药指纹图谱研究 体内药代动力学研究 药物筛选研究,药物代谢研究,药物代谢与药物动力学研究技术上的最新重大进展是 LC-MS-MS 的使用，电喷雾 （ESI）和大气压化学电离（APCI）以及大气压光电离（APPI）是其主要的离子源，由于具有高灵敏度（ng/mlpg/ml），高选择性（检测特定的碎片离子）、高效率（每天可检测几百个生物样品和对药物结构的广泛适用性，对液态样品和混合样品的分离能力高，可通过二级离子碎片寻找原型药物并推导其结构，LC-ESI-MS-MS 已广泛地应用于药物代谢研究中一期生物转化反应和二期结合反应产物的鉴定、复杂生物样品的自动化分析以及代谢物结构阐述等，已在世界上大型制药企业中取代 HPLC而占据了主导地位，其测试的样品量占总量的 70%以上。,天然产物天然药物的研究,目前中药开发研究有两条途径。一条途径是从单一植物中提取一种有效成分(单体化合物)或提取物开发成新药。 另一途径则是中药复方制 剂的开发研究。 采用现代多种仪器联用新技术， 特别是高效液相色谱/质谱/质谱联用 (HPLC-MS/MS)， 可对其十几种乃至几十种化学成分进行指纹图谱分离 鉴定。再从指纹图谱中选择四、五种指标成分(有效成分或特征成分) 进行定量，可以确定出简化的指纹图谱和指标成分，又是最合理的中药复方质量控制的方法，是研究中药复杂体系，尤其是复方的有力工具。国内外很多学者已进行了复方丹参、清开灵、泻心汤、人参或党参制剂等中药中的主要成分的分析。,临床诊断和疾病生物标志物的分析,欧美等目前已广泛采用 HPLC/MS/MS 法用于临床诊断以及疾病生物标 志物的研究、检测，具有专一性好、灵敏度高、成本低、分析快速， 经济效益可观等特点。目前可进行新生儿遗传疾病筛选（PKU、MCAD 等四十种左右）、新生儿性激素变异的检测、男女激素的监测、老年 痴呆症的早期诊断、抗排异药物的检测、磷酸脂的检测、血红蛋白变 异检测、糖化血红蛋白（糖尿病早期检测）、某些心脏病、癌症疾病 筛查如乳腺癌等等（Biomarker 法、通过鉴定 DNA 损伤程度测定）、 药物剂量监测、药物相互作用监测、地区性突发性中毒病人的毒物检 测等。,残留、法医学和环境样品测定,专家指出，中国入世后，食品工业最大的问题就是“安全壁垒“，这将 给中国的进出口和国内企业带来极大的威胁。 美国食品与药品管理局 (FDA)、欧盟、日本、韩国等主要贸易国和地区公布了在进口动物源 性食品中禁止使用的药物名单，提高了最高限量标准。这就要求中国 加强农、畜、水产品中的农药、兽药等残留的控制和检测。 同样随着人类对生存环境的倍加关注，要求对环境中各种污染物、有 害或有毒物以及法庭科学中毒物、滥用药物等进行更加严格的监控。 而配以 ESI、APCI 和 APPI 离子化技术的 LC/MS/MS 以分析速度快、灵 敏度高、特异性好等特点广泛应用与残留和毒物分析。目前已成功地 进行数百种农药、兽药、抗生素、兴奋剂类残留和毒物、毒素如氯霉 素、磺胺类、硝基呋喃类、毒品、多环芳烃等等化合物的检测。,下面讲解应用示例- 高效液相色谱电喷雾串联质谱法测定清开灵复方中胆酸,采用 HPLC/MS/MS 技术，从清开灵注射液中，通过分子量、二级质谱 碎片信息定性测定了清开灵复方中的胆酸。 直接进样实验。清开灵注射液经过初步化学处理后采用电喷雾（ESI） 离子源，在负离子扫描方式下，得到一极质谱图、即分子离子峰 M-H-，再用二级质谱（MS/MS）扫描目标分子离子的碎片峰。再以相同的实验条件对标准品进行测定，做出其一级、二级质谱图。通过对样品进行分子离子峰的扫描发现M-H-的峰中有一个很强的 407，根据样品处理过程以及对复方各单味药材的研究，其应该为一 有机酸的负离子峰，并初步推断其为胆酸。（胆酸的分子量为 408）。 如图所示：通过对照样品(右)和标准品（左）的二级质谱图，发现其 主要碎片峰均吻合较好。,如何用 API LC-MS/MS 检测硝基呋喃类代谢物,第一步：配制衍生化后的硝基呋喃代谢物标准溶液，乙腈/水体系， 浓度 10PPM 确认仪器已经校准，气体、电压工作正常。 测试条件： 离子化方式: ESI+ 进样 5ul/min， Q1 SCAN 观察 M/Z 335，236，249，209 及同位素内 标峰，通过调节 DP，使这几个峰最强。 注意：1 如买来的是已经衍生化的标