《基因文库的构建》PPT课件.ppt

第三章 基因文库的构建,主要内容,第一节 DNA基因文库 第二节 亚克隆 第三节 克隆DNA序列的体外诱变 第四节 基因编码序列的丙氨酸扫描诱变,2,DNA片段 的获得,载体构建,细菌转化,重组体 的鉴定,限制性内 切酶消化,机械切割,双链cDNA 的合成,化学法 直接合成,同聚物 加尾,粘性末端 连接,平末端 连接,加接头造成 粘性末端,重组噬菌体 DNA转染,重组质粒 的转化,体外包装 进行转导,表型鉴定,核酸杂交,免疫学分析,酶切鉴定,大肠杆菌作为寄主进行DNA克隆的实验方案,3,School of life sciences Nantong University,用载体EMBL3A构建基因组文库,4,第一节 DNA基因文库,用限制性内切酶酶切整个基因组DNA，把所得到的大量基因组DNA片段与载体连接，然后转化到细胞中去，让宿主菌长成克隆。是某个生物体全部基因的随机片段的重组DNA克隆群体。 cDNA文库：某个特定物种或器官的所有mRNA的组合。 建立DNA文库的目的：从复杂的基因组中分离基因。,5,二、 DNA文库的构建,（一）、基因组DNA库 1、 用克隆载体构建基因组文库 Question 1：构建含多少重组子的库能覆盖一个选定的基因组？ 考虑两个因素：载体的装载能力 目标基因组的大小,6,（一）、基因组DNA库 Question2：如何保证目标基因包含在所构建的文库中？ 考虑两个实际问题： 选择的载体装载量 所用的内切酶对基因组DNA的完全切割频率和不完全切割,二、 DNA文库的构建,7,人类基因组2.8X106Kb 置换载体的平均置换片段20Kb 重组子的最小数目n1.4X105 考虑取样，酶切等原因，某些基因可能有多个重组子，而某些基因完全不包含。通过概率的统计，人类基因组中某个特异的片段有95概率包含所需要的重组子为 n4.2X105,二、 DNA文库的构建,8,2、高容量载体构建基因组克隆 优点： A、所需要的重组子少（即文库中包含的克隆数目较少）。 B、目标基因相对比较完整。,二、 DNA文库的构建,9,第二节 亚克隆,概念：对已经获得的目的DNA片段进程重新克隆，目的是对目的DNA进行进一步分析，或进行重组改造等。 过程：1）目的DNA片段和载体制备；2）目的DNA片段与载体相连；3）连接产物的转化；4)重组子的筛选,10,第二节 亚克隆,对大片段的插入片段进行亚克隆的过程 1）首先确定该大片的限制酶酶切图谱 2）根据已知的酶谱进行定向克隆 3）或鸟枪法进行随机克隆,11,通过作图标出一个DNA分子上的不同限制性位点。 以DNA为例,12,13,按照诱变产生的不同效果分类： 随机诱变：在克隆化的基因序列中随机产生各种诱变。 化学诱变、盒式诱变、随机缺失诱变等 定点诱变：体外特异地改变目的DNA序列中某个碱基的技术称为定点诱变 PCR介导的定点诱变、寡核苷酸介导的诱变（如kunkel法）,第三节：克隆DNA序列的体外诱变,14,第三节：克隆DNA序列的体外诱变,一、缺失诱变 1、通过从末端或中间删除一些核苷酸序列 末端删除部分序列,15,末端标记,外切酶III处理,SI核酸酶处理,Klenow 酶，连接酶处理,16,一、缺失诱变 2、通过酶切图谱完成中间缺失,17,二、盒式突变 1、原理：利用一段人工合成的具有突变序列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的相应序列。 2、人工合成的突变序列的特征 由两条合成的寡核苷酸组成的,当它们退火时,会按设计要求产生出克隆需要的粘性末端, 由于不存在异源双链的中间体,因此重组质粒全部是突变体。,第三节：克隆DNA序列的体外诱变,18,盒式突变举例1,School of life sciences Nantong University,A AATTC TTTCGA G,AGCT,TTAA,Melt and anneal oligos T4 polynucleotide kinase,Gel purify vector DNA,Mutagenic oligonucleotides,T4 DNA ligase,Transformed into E coli,优点： 快速高效 无异源双链的形成 无需DNA聚合酶 缺点: 需要在目标序列的两侧具有限制性内切酶的位点,19,Xho I,Sph I,C,C,盒式突变举例2,利用混杂寡聚核苷酸方法的随机突变,20,第三节：克隆DNA序列的体外诱变,三、定点诱变的PCR方法,21,三、定点诱变的PCR方法 根据靶DNA序列设计一对互补的内侧引物c和b(c和b互补)，他们在相同的位点具有同样的碱基突变； 分别以左侧引物ac和右侧引物bd进行两轮PCR扩增； 除去未参入的多余引物，由于具有重叠序列，故经变性和退火形成异源双链分子 其中只有具3凹陷末端的双链分子可通过TaqDNA聚合酶的及外侧引物a和d的作用下，形成其突变位点是位于靶DNA序列中但远离两端的突变体。,第三节：克隆DNA序列的体外诱变,22,四、引物延伸：单引物法（不依赖PCR反应） 1、原理 利用一段人工合成的，与互补的序列有一个碱基错配的寡核苷酸片段（720碱基）, 并由该寡核苷酸引导DNA的体外合成。,第三节：克隆DNA序列的体外诱变,23,(1) 正链DNA的合成 按照体外DNA重组技术,将待突变的DNA片段插入到M13噬菌体上. 然后制备含有目的基因的M13 单链DNA,即”正链”DNA. (2) 突变引物的合成 应用化学方法合成带错配碱基的诱变剂寡核苷酸片段,它在以单链M13DNA作模板的体外DNA合成中是作为引物使用,所以叫做突变引物序列,或”负链” DNA,24,(3) 异源双链DNA的制备 将突变引物DNA5端磷酸化后,与含目的基因的M13单链DNA混合退火. 结果在待诱变的核苷酸部位及其附近形成一小段具碱基错配的异源双链DNA。在Klenow酶的催化下，引物链以M13单链DNA为模板，直至合成出全长的互补链。再由T4DNA连接酶连接，最终在体外合成出闭环的异源双链M13DNA分子。,25,(4) 转化 这些体外合成的闭环异源双链DNA分子转化大肠杆菌细胞后，产生出同源双链DNA分子。其中有的是原来野生型DNA序列，有的是含突变碱基的序列，因此，转化子细胞会产生两种类型的噬菌体，一种是野生型的，另一种是突变型的。 (5) 突变体的筛选,26,(d),Primer A,Primer A,27,五、寡核苷酸介导的定点诱变,1背景介绍（ Kunkel 法） dut-dUTP 酶缺陷，细胞不能把 dUTP 转化为 dUMP ，因此细胞内 dUTP 的含量大为增加，其中一些 dUTP 可掺入 DNA 中正常情况下由胸苷嘧啶占据的位置。 ung -UDG 酶缺陷， UDG 酶尿嘧啶（uracil）-N-糖基化酶（glycosylase）可除去掺入 DNA 中的尿嘧啶残基。,28,（五）寡核苷酸介导的定点诱变,29,Kunkel 法原理，过程包括： 当含目标 DNA 插入载体并进入 E.coli CJ236 由于该菌体 ung- dut- 突变，合成的 DNA 上含有少量尿嘧啶（取代胸腺嘧啶）。 M13K07 辅助感染下，产生带 U 的单链 DNA 。 与引入诱变的引物复性。,30, 在 T7DNA polymerase 和 ligase 作用下，以带 U 的单链 DNA 为模板合成一条新链，形成杂合双链（新生链中无U碱基）。 感染 dut+ ung+ E.coli MV1190 后，在细胞分裂过程中，只有新合成的 DNA 链才能起模板作用合成新的并引入了诱变位点的子代双链 DNA 。而有 U 的 DNA 链，在 dut+ 和 ung+ 产物的作