《免疫组织化学技术》PPT课件.ppt

,1,第十二章 免疫组织化学技术,2,免疫组织化学技术的概念,在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，借助可见的标记物，对相应抗原进行定性、定位和定量检测。,3,免疫组织化学技术的类型,1.酶免疫组织化学技术 2.荧光免疫组织化学技术 3.免疫电镜技术 4.亲和免疫组织化学技术,4,免疫组化技术要点,标本的制作 抗体的选择 温育 改善标本的透过性 设立对照试验 免疫组化的结果判断,5,标本的制作,标本的类型 1.组织切片：冷冻切片；石蜡切片 2.印片 3.涂片 标本的固定 标本的保存 酶消化处理,6,设立对照试验,阳性对照 阴性对照：空白对照、替代试验、 吸收试验,7,酶免疫组织化学技术的概念,用酶标记已知抗体（抗原）与组织或细胞标本在一定条件下反应，如果组织或细胞中含有相应抗原（抗体），抗原抗体结合形成复合物，复合物中的酶催化底物显色，对抗原（抗体）进行定性、定位和定量。,8,酶免疫组化技术的类型,1.酶标记抗体免疫组化染色法 2.非标记抗体免疫酶组化染色法,9,酶标记抗体免疫组化染色法,直接染色法 间接染色法,10,直接染色法原理,用酶标抗体直接与标本中的相应抗原反应，形成酶标抗体-抗原复合物，最后加底物显色，形成有色产物沉积在抗原抗体反应部位，对组织或细胞抗原定位、定性和定量。,11,直接染色法技术要点,（1）用0.3% H2O2和80%甲醇室温处理标本2030min，洗涤。 （2）用正常血清或BSA溶液处理标本。 （3）加酶标抗体，温育，使形成Ag-AbE复合物，洗涤。 （4）加底物，光镜下观察显色结果。,12,直接染色法方法评价,直接染色法简便、快速、特异性强，非特异性背景反应低，结果可靠，可精确定位抗原，切片保存时间较长。常用于检测肾组织活检标本中的免疫球蛋白、补体等免疫复合物成分。 缺点是不同抗原需分别制备相应的酶标抗体进行检测，比较麻烦，且敏感性不及间接染色法。,13,间接染色法原理,间接染色法先用未标记的已知抗体与标本中的相应抗原反应，形成复合物，再用酶标抗抗体与之反应，形成抗原-抗体-酶标抗抗体复合物，通过底物显色，根据底物显色反应对抗原定位、定性和定量。,14,间接染色法技术要点,（1）和（2）同直接法。 （3）加稀释的Ab1，温育，使形成Ag-Ab1复合物，洗涤。 （4）加稀释的酶标Ab2，温育，使形成Ag-Ab1-Ab2E复合物，洗涤。 （5）加底物，光镜下观察显色结果。,15,间接染色法方法评价,间接染色法使用一种酶标抗抗体即可与多种特异性抗体匹配，可检查多种抗原，实用性和敏感性均强于直接染色法，现已广泛应用于检测组织细胞中的病毒、细菌、寄生虫和某些肿瘤抗原等。间接染色法的缺点是敏感性低于酶桥染色法和PAP法。,16,非标记抗体免疫酶组化染色法,酶桥法 PAP法 双桥PAP法 APAAP法,17,酶桥法原理,利用抗原和特异性抗体（第一抗体）形成免疫反应系统，用抗抗体（第二抗体，又称桥抗体）将抗酶抗体结合在与组织抗原结合的第一抗体上，再将酶结合在抗酶抗体上，经显色对抗原定位、定性和定量 。,18,酶桥法原理,19,酶桥法技术要点,（1）、（2）和（3）同间接法。 （4）加Ab2，温育，使形成Ag-Ab1-Ab2复合物，洗涤。 （5）加抗酶抗体，温育，使形成Ag-Ab1-Ab2-Ab(E)复合物，洗涤。 （6）加酶反应液，温育，与Ab(E)反应，洗涤。 （7）加底物，光镜下观察显色结果。,20,酶桥法方法评价,该方法未经化学交联，故避免了抗体和酶活性的降低，并省去酶标记抗体需纯化的繁琐过程。,21,PAP法的原理,抗过氧化物酶抗体（第三抗体）与过氧化物酶结合，形成过氧化物酶-抗过氧化物酶抗体（PAP）复合物，用此复合物代替酶桥法中的抗酶抗体和酶，把酶桥法的两步变成一步，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP复合物，最后通过PAP复合物中的HRP催化底物显色。,22,PAP法的原理,23,PAP法技术要点,（1）、（2）、（3）和（4）同间接法。 （5）加PAP复合物，温育，使形成Ag-Ab1-Ab2-PAP复合物，洗涤. （6）加底物，光镜下观察显色结果。,24,PAP法的方法评价,PAP法未经化学交联，故避免了抗体和酶活性的降低，并省去酶标记抗体需纯化的繁琐过程。PAP是由2个抗酶抗体和3个过氧化物酶分子组成的复合物，稳定性好，酶分子不易在染色冲洗过程中脱落。PAP中不存在游离的免疫球蛋白，不易产生非特异性染色，因而特异性、敏感性和重复性良好，比直接染色法、间接染色法和酶桥法更敏感。缺点是PAP复合物制备过程较复杂。,25,双桥PAP法原理,该法是PAP法的改良法，通过两次连接桥抗体和PAP，在抗原抗体复合物上结合比PAP法更多的酶分子，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2-PAP复合物，最后通过PAP复合物中的HRP催化底物显色。,26,双桥PAP法技术要点,（1）、（2）、（3）、（4）和（5）同PAP法。 （6）加Ab2，温育，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2复合物，洗涤。 （7）加PAP，温育，形成Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2-PAP复合物，洗涤。 （8）加底物（DAB-H2O2），光镜下观察显色结果。,27,APAAP法,APAAP法与PAP法相似，不同之处是用碱性磷酸酶（AP）代替HRP。骨髓等造血组织含有大量类过氧化物酶，染色时不宜使用HRP结合物，AP可避免上述缺点，但制备高纯度的AP和APAAP复合物过程较复杂，且价格较贵。,28,参考文献,Ivan M Roitt.Immunology(6th edition). Harcourt Publoshers imited,2001. 龚非力.医学免疫学.北京：科学出版社，2003. 吕世静.临床免疫学检验.北京：中国医药科技出版社，2004. 吕世静.免疫学检验（第2版）.北京：中国医药科技出版社，2003. 孙汶生 王福庆.医学免疫学.北京：科学出版社，2004. 吴健民.免疫学检验-理论与临床.北京：人民卫生出版社，2003.,29,免疫网站,Immunology /imm/ Medweb:Immunology /medweb/medweb.imm