《核酸的凝胶电泳》PPT课件.ppt

第四节 核酸的凝胶电泳 Nucleic Acid Gel Electrophoresis,Content of Table,前 言 一、 琼脂糖凝胶电泳 二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳 三、 脉冲场凝胶电泳,前 言,核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段； 优点：（1）便于分离;（2）便于检测;（3）便于回收：,核酸凝胶电泳的基本原理,1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移； 2）由于在电泳中往往使用无反应活性的稳定的支持介质，电泳迁移率（或迁移速度）与分子的摩擦系数成反比。而摩擦系数是分子大小、介质粘度等的函数； 因此，可在同一凝胶中、一定电肠强度下、可在凝胶上分离出不同分子量大小或相同分子量但构型有差异的核酸分子。,Home,一、 琼脂糖凝胶电泳 Agarose gel electrophoresis,（一）凝胶的制备及电泳,（二）DNA的迁移速率决定因素,1 DNA分子的大小 双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比； 2 琼脂糖浓度 浓度越低，相同核酸分子迁移越快；,3 DNA的构象 一般同一分子：超螺旋环状线状切口环状。 4 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭（EB）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和长度增加。,5 所用的电压 低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。 6 琼脂糖种类 常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；,不同类型琼脂糖的性质,不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围,7 电泳缓冲液 常用的有TAE、TPE及TBE,TAE、TPE及TBE电泳缓冲液比较,都是常用电泳缓冲液。三者相比： 1）TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的阳极一侧将发生酸性化； 2）TBE和TPE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量； 3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%； 4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，对于低分子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。,（二） 凝胶载样缓冲液,载样缓冲液：临上样到凝胶加样孔之前与待电泳的样品相混合的一种缓冲液。 载样缓冲液有三个作用： 1）增加样品密度保证DNA沉入加样孔内； 2）使样品带有颜色便于简化上样过程； 3）其中的染料在电场中以可以预测的泳动速率向阳极迁移。,6凝胶载样缓冲液,（三）琼脂糖凝胶中DNA的检测,通过染色, 紫外灯下检测。 主要有溴化乙锭（ethidium bromide, EB）染色法和SYBR Gold染色法。,1 凝胶的EB染色,使用EB染色注意事项,（1）EB被认为是一种强致癌物质 （2）EB可用来检测单链或双链核酸,（3）EB使用时的配制、贮存及使用 EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液，于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 g/ml 。,（4）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。,2 凝胶SYBR Gold的染色,SYBR Gold是一种新型极敏感染料的商品名称。其与DNA结合的亲和力高，并且结合后，能够极大增强荧光信号。,（四） 凝胶中DNA的成像,可以用透射或入射紫外光对EB染色的凝胶成像，图像可以直接输出到计算机观察。,（五） 凝胶中DNA的回收,现一般采用试剂盒回收： 存在的主要问题： 1 不能有效的回收大片段DNA 2 不能有效回收少量DNA,Home,二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳 polyacrylamide gel electrophoresis PAGE,在TEMED (四甲基乙二胺) 催化过硫酸铵还原产生的自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的线状长链。 在双功能交联剂如N，N-亚甲双丙烯酰胺的参与下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状网格结构。 网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。,（一） 聚丙烯酰胺凝胶的本质,CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺） CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 （N，N-亚甲双丙烯酰胺）,（二） 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类,1 变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链DNA片段的分离或纯化。 变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。 用途：放射性DNA探针的分离、DNA测序反应等。,2 非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链DNA片段的分离和纯化。 注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。 用途：制备高纯度的DNA片段。,（三）DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围,注:N,N-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/30;,Home,三、 脉冲场凝胶电泳 pulsed-field gel electrophoresis PFGE,为何选PFGE？ 超过一定大小的线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶中以相同速率迁移。大于该极限长度（40kb）后DNA的迁移速率几乎与分子大小无关，而主要决定于电场强度。但 PEGE 解决了这一问题。,（一） PFGE 工作的基本原理 这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出反应所需的时间取决于它的大小。 该法可分离长至5Mb的DNA分子。严格说来，应叫交替电场凝胶电泳。,脉冲电场电泳示意图,（二）PEGE类型,垂直脉冲场电泳系统(vertical pulsed field) 场翻转系统(field inversion) 旋转胶系统(rotating gel) 箝位匀强电场系统(contour-clamped homogeneous electric field),垂直交变电场系统,场翻转系统,箝位匀强电场系统,旋转胶系统,（三） 影响分辨率的因素,1 脉冲时间（0.1s-1000s)：增加脉冲时间分离较大分子，减少脉冲时间分离较小分子。 2 电压：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大了可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度会导致较小片