离子液体中酶催化拆分布洛芬的反应研究

宝鸡文理学院化学化工院毕业论文题目：离子液体中酶催化拆分布洛芬的反应研究学生姓名侯磊磊（200992074044）指导教师黄卓楠班 级2009化学工程与工艺1班专 业化学工艺学 院宝鸡文理学院2013 年 5月27日目 录摘要11 前言21.1脂肪酶简介21.2离子液体概述31.3酯化反应41.4本论文选题目的和意义及主要内容52 实验部分52.1实验材料52.2酶催化拆分反应52.3产物分析52.4对映选择性的计算63 结果与讨论63.1酶的筛选63.2异辛烷和BMIMPF6溶液比例的影响83.3反应时间的影响93.4酶的负载效应104 结论11参考文献12谢辞1313离子液体中酶催化拆分布洛芬的反应研究侯磊磊*交稿日期：2013-05-27 指导教师：黄卓楠 作者简介：侯磊磊(1989-)，男，陕西宝鸡，化学化工学院2013届毕业生（宝鸡文理学院 化学化工学院，陕西 宝鸡 721013）摘 要：在分别含有BMIMPF6和BMIMBF4两种离子液体的体系中，将两种天然酶和四种商品酶用于拆分布洛芬的反应。与纯异辛烷相比，在含有离子液体的异辛烷体系中脂肪酶表现出较高的转化率。虽然，柱状假丝酵母菌商品酶的对映体选择性（E=8.5）相比其他酶高，但还有另一种天然脂肪酶，同样具有良好的对映体选择性（E=4.6）。通过反应条件的优化（异辛烷/离子液体的比例，酶量和反应时间），AN脂肪酶(15%w/v)在BMIMPF6：异辛烷=1:1体系中反应96小时后可以获得更高的对映体选择性（E=9.2）。关键词：脂肪酶；布洛芬；离子液体Esterification of (R, S)-Ibuprofen by native and commercial lipases in a two-phase system containing ionic liquidsHou Lei-lei( College of Chemistry and Chemical Engineering, Baoji University of Arts and Sciences, Baoji 721013 China )Abstract: Four commercially available lipases and two native lipases from Aspergillus niger AC-54 and Aspergillus terreus AC-430 were used for the resolution of (R, S)-Ibuprofen in systems containing the ionic liquids BMIMPF6 and BMIMBF4. The lipases showed higher conversion in a two-phase system using BMIMPF6 and isooctane compared to that in pure isooctane. Although the best enzyme was a commercially available lipase from Candida rugosa (E =8.5), another native lipase, produced in our laboratory, from A niger gave better enantioselectivity (E= 4.6) than the other lipases tested (E=1.9-3.3). After thorough optimization of several reaction conditions (type and ratios of isooctane/ionic liquid, amount of enzyme, and reaction time), the E-value of A. niger lipase (15% w/v) could be duplicated (E= 9.2) in a solvent system composed of BMIM PF6 and isooctane (1:1) after 96 h of reaction.Keywords: lipases, Ibuprofen，ionic liquid1.前言1.1 脂肪酶简介脂肪酶( Lipase EC3，甘油酯水解酶)是一类水解油酯的酶类。脂肪酶的水解底物一般是天然油脂，其水解部位是油脂中脂肪酸和甘油相连接的酯键。不同于其它水解酶,脂肪酶催化作用系统是一种非均相体系。水溶性的酶催化作用发生在水不溶性底物和水的界面上。这种界面上的催化作用机制仍不甚清楚，不能简单用Michaelis-Menten学说解释酶与底物间的反应机制。有人提出了脂肪酶在油水界面上定位的假设,提出了超底物的模型,该模型能解释脂肪酶的一些行为，但还需要进一步的实验证明和修正。此外，脂肪酶兼具有逆向催化甘油和游离脂肪酸合成甘油脂活性1。由于脂肪酶独特的催化特性，活力测定具有以下特点：（1）方法的多样性；（2）测量过程影响因素的复杂性；（3）酶活力定义的混乱性。本文对脂肪酶活力测定方法及影响因素进行综述。测定脂肪酶的方法可分三类：（1）通过测定底物的减少来度量酶活的大小；（2）测定产物增加判断酶活的大小；（3）其他方法。由于微生物脂肪酶种类多，作用温度及pH:范围比动植物脂肪酶广、底物专一性高，并且便于工业生产和获得较高纯度的酶制剂，因此微生物脂肪酶已成为工业生产脂肪酶的主要来源，关于脂肪酶在工业应用的研究也越来越多2。脂肪酶是一种“丝氨酸水解酶”构成脂肪酶活性中心的三元组之间，丝氨酸残基通过氢键和组氨酸相连。反应过程中，三者通过与底物形成四面体中间体复合物完成催化过程。通常情况下，脂肪酶的活性部位被一个螺旋片段（又称“盖子”）所包住。在底物（如醇酸或酯）存在的情况下，酶的结构发生变化，“盖子”打开，含有活性部位的疏水部位就暴漏出来。“盖子”螺旋的双亲性会影响脂肪酶与底物在油/水界面的结合面能力，其双亲性的减弱将导致脂肪酶活性的降低。“盖子”的外表面积相对亲水，而其面向催化部位的内表面则相对疏水。由于脂肪酶与油/水界面的缔合作用，使“盖子”张开，活性部位得以暴漏，这使得脂肪酶与底物的结合能力增强，此时第五就容易进入疏水性的通道而与活性部位结合，形成酶-底物复合物。液体测定体系：甘油三酯和水制成的乳胶，因胶束对入射光的吸收或散射具有乳浊性状，当胶束中的甘油三酯在脂肪酶催化转变为甘油和脂肪酸，导致胶束分裂，悬液散射光或浊度下降。通过检测甘油三酯乳化液在340nm或365nm的吸光度随时间的降低，来测定酶活力的大小。例如英国RANDOX公司提供的试剂盒，其主要成分是：缓冲液(26mmol/ L，pH9.2) 、去氧胆酸钠(35 mmol/ L)、氯化钙(4 mmol/ L)，三油酸甘油酯(0. 3 mmol/ L)，co-lipase(3mmol/ L)，同时还备有脂肪酶标准液。该方法的缺陷是早期反应阶段的非线性及其线性范围有关，同时为了获得准确可靠的数值，用纯的脂肪酶溶液作标准曲线是必要的。目前该方法已成功用于血清脂肪酶的测定3-4。1.2.离子液体概述离子液体是由有机阳离子和无机或有机阴离子构成的在室温或接近室温下呈液态的盐类5。它完全由离子构成，没有明显的蒸气压，对热稳定并具有高的极性。离子液体作为一种新兴的绿色试剂为酶催化反应开辟了广阔的前景。与有机溶剂不同，离子液体集高极性和低亲水性为一体，这使得它能够保持酶的催化活性构象并赋予其一定的构象可变性。离子液体的广谱底物溶解范围也使其能够同时溶解极性和非极性化合物。离子液体在有机合成中的应用研究近几年发展快，多数离子液体表现出中等极性有机溶剂的性质，极性相当醇和两极非质子溶剂，能促进反应速度,因此离子液体被作为反应介质、促进剂和催化剂应用于不同的合成方法中6-7。离子液体具有较强的极性，可溶解高极性底物，其良好的热稳定性、可以忽略的蒸汽压和物性可调控等优良的性质，使其有望成为非水相酶催化的新介质，酶在不同有机溶剂中有不同性能。同样，酶在离子液体中的活性、稳定性和选择性也变化多端。目前在大多数研究中都是将离子液体直接作为酶催化反应的溶剂，实验结果较为随机，无规可循，给探讨离子液体在酶催化反应中的作用带来了一定的困难。另一方面，由于离子液体的强极性，少量离子液体即可改变反应溶剂系统的性能，因此离子液体更有望成为酶催化反应溶剂工程的调控工具，所以有必要研究少量离子液体的存在对非水相酶催化酯化反应的影响。离子液体BMIM PF4和BMIMPF6中几种脂肪酶催化2-羟甲基-1,4-苯并二恶烷和乙酸乙烯酯的酯交换反应显示：PCL在BMIMPF6中的反应速率较在BMIMPF4和二氯甲烷中高，可能是两种离子液体亲水性不同的缘故。在无水BMIMPF4中反应速率逐渐降低，可能因为脂肪酶表面水分的丢失所致。在石油炼制工业中，几乎所有重要的工艺转化技术，如催化裂化、异构化、烷基化和重整都与酸催化反应密切相关。在揭示和描述酸催化烃类转化反应的历程和机理时，正碳离子反应机理是大家所公认的最有效的工具8-11。1.3 酯化反应(动力学拆分反应)酯是一大类重要的精细化工产品,应用范围涵盖了生产生活的方方面面，如用于合成香料、化妆品、食品及饲料添加剂、表面活性剂、防腐防霉剂、橡胶及塑料的增塑剂、制药工业的原料和中间体等12。在有机溶剂体系中，用酶催化醇的对映选择性酰化，是合成具有光学活性化合物及拆分外消旋醇的常用方法。在工业上，脂肪酶催化酯基转移反应被广泛应用于药物、农药、香料、保健品及中间体的合成。然而，底物的溶解性、酶在常见有机溶剂体系的活性问题常常导致收率和光学纯度的降低。KIM等在离子液体中考察了几种不同的仲醇与乙酸乙烯酯在脂肪酶催化下的酯基转移反应，发现产物ee(光学纯度)值高达99. 5 %，脂肪酶可以附着在离子液体中，产物经过分离后，脂肪酶/离子液体可以循环使用，尽管速率减慢，但是产物光学纯度并不降低。与传统的有机溶剂(THF，甲苯) 相比，在BMIMPF6或BMIMPF4中，产物的对映选择性得到了显著提高(可达25倍以上)。SCHOFER等在10种纯离子液体中，通过与乙酸乙烯酯的酯基转移反应对苯乙醇进行了动力学拆分。结果表明，某些以离子液体为介质的反应，与在有机溶剂甲基叔丁基醚(MTBE)中相比，酶的活性和产物的立体选择性都有明显提高。反应结束后，可通过蒸馏的方法得到分离的产物，同时在离子液体中，酶表现出良好的热稳定性，悬浮于离子液体中的酶可循环使用3次，尽管活性以10 %递减，但是选择性并不受影响。陈治明等13研究了以氯铝超酸型离子液体催化合成乙酸乙酯的酯化反应。结果表明，该类型离子液体具有良好的催化活性，乙酸转化率在10min内能达到95%，生成的酯与离子液体分层两相，催化剂可重复使用。马卫华等14合成了BuPyCl-AlCl3、EMIMBF4等离子液体，并应用于催化合成反丁烯二酸二乙酯。1.4本论文选题目的和意义及主要内容离子液体对于有有机化合物的拆分反应有及其关键的作用，它能够提高对映体的转化率和选择性，同时离子液体对于不同的脂肪酶会表现出不同的性质，每种离子液体都有其对应的高效酶，而且由于离子液体的不同性质对于酶的拆分反应有不通的结果。本实验对比观察，找出最有效的酶和离子液体系，从而提高布洛芬拆分反应。2 实验部分2.1 实验材料南极假丝酵母菌脂肪酶(CA)、洋葱假单胞菌酶(TL)和米黑根毛菌(RM)购自诺维信有限公司；柱状假丝酵母菌脂肪酶(CR)以及果胶酶(AN)购自西格玛化工(在pH=7.0和40条件下水解橄榄油，酶的活性0.56mol/min/mg）。离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，离子液体BMIMBF4，1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐BMIMPF6，异辛烷，异丙醇和(R, S)-布洛芬购自西格玛-奥德里奇化工药品公司。2.2 酶催化拆分反应4mmol(R, S)-布洛芬和12mmol的丙醇放置在锥形瓶中，再加入250l的异辛烷溶解。分别加入5%（w/v）脂肪酶，10%（w/v）的活性分子筛（4），250l的离子溶液BMIMPF6或BMIMPF4。反应混合物在35、300转/分下搅拌。间隔取样，加入500L异辛烷,与混合溶液系统强烈搅拌3分钟，然后从异辛烷那一相中提取到底物和产物，通过气相色谱法和HPLC法分别测定转化率和(S)-对映体的过剩值。2.3 产物分析使用CHROMPACK CP 9001气相色谱法离子化检测器和CP-Sil 5 CB色谱柱（10m0.25mm0.12m）。注入温度为300，检测温度为350，烘箱的温度保持在150。载气流量为12mL/min。采用外标法测定产物和底物的浓度。对于底物的对映体选择性通过使用Chiralcel OD手性柱进行手性分离，然后使用HPLC进行测定。2.4 对映选择性的计算对映体选择性（E值）是通过对映体过剩值（ee）和转化率计算出来的。利用上述的方程式，通过得到对映体过剩值和产物的转化率，确定该酶催化拆分时的E值。3 结果与讨论3.1 酶的筛选研究了离子液体对酶催化拆分(R, S)-布洛芬的影响，我们设计了一个实验，其中的离子液体BMIMPF6和离子液体BMIMBF4作为添加剂（共溶剂）加到溶剂异辛烷中。在第一阶段，本实采用等量的离子液体（250L）和异辛烷（250L）为反应体系。由于异辛烷与粒子液体不混溶，所以该反应发生的两相体系中。图1显示反应48小时后，六种酶对催化拆分反应的转化率。图1 (R, S)-布洛芬分辨率在几种脂肪酶的筛选从图可以看出，在(R, S)-布洛芬酯化反应，最有效的脂肪酶是CR，CA和RM。在含 BMIMPF6 +异辛烷（1:1）的两相体系中可以得到最高转化率（分别为48%，35%，和25%）。相比使用纯异辛烷溶剂介质转化率增加了2025%。在含有BMIMPF6溶剂的体系中，AN天然脂肪酶的活性显著增高（比在异辛烷溶液中提高了50%）。但在混合离子液体BMIMBF4 +异辛烷体系中没有观察到明显的现象。在某些情况下，如RM和CR脂肪酶，BMIMBF4对酶活性是不利的（比在纯异辛烷中减少了40%）。用于本研究的两种离子液体BMIMPF6和BMIMBF4, 在它们的性质有明显差异，如疏水性，极性，阴离子的亲核性，酸碱性和黏度。离子液体BMIMBF4在本质上是高亲水性的，而离子液体BMIM PF6是高疏水性的，这由于有机阳离子上结合的阴离子不同造成的。这一特性是在酶催化反应中首要关注的问题，因为他们它能够影响脂肪酶的构象和反应结果。在含有BMIMBF4的体系中，(R, S)-布洛芬的转化率降低，可能是由于这种脂肪酶失去了最基本的构型水。然而，这一领域还是很新，还需进一步了解离子液体对生物催化反应的作用。如表1所示，对比五种酶在纯异辛烷体系与含有BMIMPF6离子液体的异辛烷体系中，(R, S)-布洛芬的转化率（c）对映体过剩值（ee）和对映体选择性。表1(R, S)-布洛芬由天然的商业脂肪酶催化在纯异辛烷或异辛烷+BMIMPF6（1:1）中反应48小时脂肪酶溶剂C（%）ee(%)E立体结构AN AC-54CACRRMTL异辛烷异辛烷+ BMIM PF6异辛烷异辛烷+ BMIM PF6异辛烷异辛烷+ BMIM PF6异辛烷异辛烷+ BMIM PF6异辛烷异辛烷+ BMIM PF6812293542482025121038182435601013342.1a4.6b3.1a3.3a4.1a8.5b2.6a2.7a1.7a1.9aRRRRSSRRRRCR在含有BMIMPF6离子液体的异辛烷体系中与纯异辛烷体系相比，获得了最高的转化率（48%），对映体过剩值（60%）和E值（8.5）。在离子液体存在的体系中转化率没有明显的提高（从42%提高到48%），但是对映体选择性增加了1倍（从4.1提高到8.5）。相同条件下，在含离子液体BMIMPF6体系中AN脂肪酶E值同样显著增加（从2.1提高到4.6）。这与我们以前的研究结果一致，脂肪酶表现出特异的立体选择性。RM和CA脂肪酶表现出较高的反应活性，但在催化拆分反应中其对映体选择性较差。这些结果表明，在布洛芬酯化反应中CR和AN脂肪酶表现出最高的反应活性和立体选择性，因此选择他们作为后续研究。3.2 异辛烷和BMIMPF6溶液比例的影响反应混合物中离子液体BMIMPF6的含量从0%增加到100%(v/v)，测定反应48小时后布洛芬的转化率和对映体选择性，结果如表2所示。表2 黑曲霉和柱状假酵母丝脂肪酶催化(R,S)-布洛芬酯化分别在异辛烷或BMIMPF6（%）溶液的影响系数异辛烷/BMIM PF6(%)AN脂肪酶CR脂肪酶C(%)ee(%)EC(%)ee(%)E100/0832.1a42354.1a70/301373.2b,c45569.1b50/501284.6d48608.5b30/7018134.1b,d38365.3a0/100953.1c38344.7a结果表明，布洛芬在异辛烷和离子液体BMIMPF6两相体系中的酯化比在纯离子液体或纯异辛烷中更容易。CR脂肪酶在含有30%离子液体BMIMPF6（E=9.1）和50%离子液体BMIMPF6（E=8.5）的体系中获得最佳的E值。AN脂肪酶在含有50%的离子溶液BMIMPF6体系中也获得最佳的E值。当使用70%BMIMPF6时也出现相同的结果。这表明在反应中同时存在异辛烷和BMIM PF6混合物时，一方面使药物的溶解度增加，而另一方面与传统溶剂相，这一点是与其他有机溶剂不同之处。这就证明了离子溶液体系中脂肪酶高的立体选择性是由于脂肪酶保持基本水而维持了基本结构不被破坏。之前就有报道称，离子液体就能够增加不同反应中脂肪酶的对映选择性。目前已经在七种液体中研究了CR脂肪酶催化拆分布洛芬的反应，只有在离子液体BMIMPF6中E值（E=24.1）几乎是在异辛烷（E=13）的两倍。在离子液体之前被作为纯溶剂或与另一种溶剂在两相系统（如有机溶剂和超临界二氧化碳）中被研究。Ganske和Bornscheuer研究发现在纯离子液体中采用CALB脂肪酶进行糖脂合成，脂肪酶不显示活性。但是，在60%BMIMPF6或BMIMPF4）离子液体中和40%的叔丁醇体系中进行糖脂合成，脂肪酶能够表现出活性。3.3 反应时间的影响表3表示在含有50%和30%的离子液体BMIMPF6体系中，AN和CR脂肪酶反应一段时间后催化拆分(R, S)-布洛芬的转化率、对映体过剩值和E值。当反应时间在24-96小时的变化范围内，AN脂肪酶的转化率从6%增加至15%，对映体过剩值由3%增大到12%，E值由2.4增加至6.4。在70%的异辛烷和30%的离子液体BMIMPF6的混合体系中，CR脂肪酶反应24小时后，(R, S)-布洛芬的转化率在40%以上，但是E值（E=9.3）没有得到进一步的增加。表3 AN和CR脂肪酶催化(R,S)-布洛芬的反应动力学拆分的反应时间影响反应时间（h）AN脂肪酶CR脂肪酶C(%)ee(%)EC(%)ee(%)E1260ND36335.1a24632.4a42519.3b481284.6b45569.1b7214104.9b44538.9b9615126.4c40478.9b3.4 酶的负载效应图2和图3是在两相系统中考察脂肪酶的用量对(R, S)-布洛芬拆分反应的影响。AN和CR脂肪酶的用量分别为5%、15%、30%和50%（w/v），当反应96和24小时后测得的数据。图2 在由50%异辛烷和50%的离子液体BMIM PF6溶液系统中反应96小时，AN脂肪酶的用量对（R,S）-布洛芬分辨率的影响图3 在由70%异辛烷和30%的离子液体BMIM PF6溶液系统中反应24小时，CR脂肪酶的用量对（R,S）-布洛芬分辨率的影响分别使用5%和15%（w/v）的AN脂肪酶得到的转化率为15%和19%，对映体的量为12%和17%，E值为6.4和9.2。使用30%和50%时，获得更好的转化率（32%、40%）和E值（28%、31%）。但是，在这些实验条件下，这种低专一性的AN脂肪酶的E值在5.2到3.7之间。另一方面，在使用50%的CR脂肪酶，使50%的转换物发生24小时的抑制反应，布洛芬能获得具有良好的ee（69%）值和E值（12），如图3。4结论离子液体能够提高(R, S)-布洛芬酯化效率，同时离子液体的酯化作用也对于相应的酶有严格的要求。在离子液体BMIMPF6和异辛烷的混合系统中，有效多的提高了(R, S)-布洛芬酯化作用的转化率和对映体选择性。对于催化拆分反应，最有效的酶是CR、CA和RM，在该溶液混合系统中脂肪酶的活性大大提高，这对于今后的工业生产研究有很大意义。并且离子液体作为溶剂污染小又可重复使用，对于微生物催化反应是极好的溶剂。参考文献1 Brockerhoff, H.R.G.Jensen(ed.). Lipolytic EnzymesJ.New York: Academic Press, 1974. 2 Jaeger K, Ransa