牵张对大鼠骨髓间充质干细胞IKCa通道表达及活性的影响

单位代码 10006 学 号 10101018 分 类 号 毕业设计(论文) 牵张对大鼠骨髓间充质干细胞牵张对大鼠骨髓间充质干细胞 IKCa通道通道 表达及活性的影响表达及活性的影响 院 （ 系 ） 名 称 生 物 与 医 学 工 程 学 院 专业名称 生 物 工 程 学生姓名 苏 豪 指导教师 贾 潇 凌 2014 年 5 月 牵 张 对 大 鼠 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 IKCa 通 道 表 达 及 活 性 的 影 响 苏 豪 北 京 航 空 航 天 大 学 北京航空航天大学 本科生毕业设本科生毕业设计计（论文（论文）任务书任务书 、毕业设计（论文）题目： 牵张对大鼠骨髓间充质干细胞 IKCa通道表达及活性的影响 、毕业设计（论文）使用的原始资料（数据）及设计技术要求： 骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stemcells，BMSCs）是骨组织工程的主要 种子细胞。其增殖和分化受多种因素如力学、化学和生物等因素的调控。 研究表明牵张可影响BMSC增殖和分化， IKCa通道也可影响其增殖和分化。 又有文献表明牵张可以影响 IKCa通道的开放。 由此可以提出一个问题： IKCa 通道是否在力学调控 BMSC 增殖分化中起作用？为了回答这一问题需开展 如下实验内容：1、牵张是否调控 BMSC IKCa通道的表达及活性；2、牵张 是否影响 BMSC 的增殖与分化；3、阻断 IKCa通道后牵张对 BMSC 增殖与 分化的影响是否还存在。我的任务主要集中在第一个问题。 、毕业设计（论文）工作内容： （1） 1.152.28： 文献调研， 实验前期准备， 熟悉实验背景， 思路以及流程， 熟悉实验所需的操作如流式细胞仪，PCR 等操作步骤 （2）3.13.15：rBMSC 的原代培养与鉴定， （3）3.164.30：rBMSC 的牵张加载与 IKCa通道蛋白、基因的检测 （4）5.15.15：添加 IKCa阻断剂 Tram-34 后膜电位变化的检测 （5）5.166.10 后期实验数据处理、论文撰写以及准备答辩 、主要参考资料： 1、 Zhang Y Y, Yue J, Che H, et al. BKCa and hEag1 Channels Regulate Cell Proliferation and Differentiation in Human Bone MarrowDerived Mesenchymal Stem CellsJ. Journal of cellular physiology, 2014, 229(2): 202-212 2、 Li G R, Deng X L. Functional ion channels in stem cellsJ. World journal of stem cells, 2011, 3(3): 19. 3、 Li G R, Deng X L, Sun H, et al. Ion channels in mesenchymal stem cells from rat bone marrowJ. Stem Cells, 2006, 24(6): 1519-1528. 4、 Deng X L, Lau C P, Lai K, et al. Cell cycledependent expression of potassium channels and cell proliferation in rat mesenchymal stem cells from bone marrowJ. Cell proliferation, 2007, 40(5): 656-670. 5、 孙健, 余优成, 顾章愉, 等. BMP-2 对大鼠骨髓间充质干细胞成骨作用的影响J. 上海口腔医学, 2011, 20(4): 352-357. 6、 Wen L, Wang Y, Wang H, et al. L-type calcium channels play a crucial role in the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cellsJ. Biochemical and biophysical research communications, 2012, 424(3): 439-445. 生物与医学工程学院 学院（系） 生物工程 专业类 101011 班 学生 苏豪 毕业设计（论文）时间： 年 月 日至 年 月 日 答辩时间： 年 月 日 成 绩： 指导教师： 兼职教师或答疑教师（并指出所负责部分） ： 系（教研室） 主任（签字） ： 注：任务书应该附在已完成的毕业设计（论文）的首页。 本人声明本人声明 我声明，本论文及其研究工作是由本人在导师指导下独立完成的，在完 成论文时所利用的一切资料均已在参考文献中列出。 作者： 签字： 时间：2014 年 6 月 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 I 页 牵张对大鼠骨髓间充质干细胞 IKCa通道表达及活性的影响 学 生：苏豪 指导老师：贾潇凌 摘要 骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stemcells，BMSCs）是骨组织工程的主要种 子细胞。其增殖和分化受多种因素如力学、化学和生物等因素的调控。研究表明牵张可 影响其增殖和分化，IKCa通道也可影响其增殖和分化。而 IKCa通道又是牵张敏感的。对 此可以提出一个问题：IKCa通道是否在力学调控骨髓间充质干细胞增殖分化中起作用? 为了回答这个问题，需要开展以下三个方面的工作：1、牵张是否调控 BMSC IKCa通道 的表达及活性； 2、 牵张是否影响 BMSC 的增殖与分化； 3、 阻断 IKCa通道后牵张对 BMSC 增殖与分化的影响是否还存在。本文的任务主要集中在第一个问题。对 rBMSC 细胞进 行 10%和 20%牵张，检测对照组和牵张组 IKCa通道基因和蛋白的表达情况。阻断 IKCa 通道，检测阻断前后膜电位的变化。结果表明牵张能够促进 IKCa通道的表达，IKCa通道 参与了这个调控过程。 关键词：rBMSC，IKCa通道，牵张，表达，活性 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 II 页 Effects of stretch on rat bone marrow mesenchymal stem cells(rBMSCs) IKCa channel expression and activity Author: Hao Su Tutor: XiaoLing Jia Abstract Bone mesenchymal stemcells(BMSCs)are the main seed cells for bone tissue engineering. Their proliferation and differentiation can be influenced by many factors such as mechanical chemical and biological factors. Studies have shown that stretch can affect their proliferation and differentiation, IKCa channel can also. Another study showed that IKCa channel is mechanical sensitive . This leads to an question: Whether does the IKCa channel work in control of proliferation and differentiation. To answer this question, those work should be developed:1 .Whether does the expression and activity of BMSC be controlled by the stretch;2.Whether does the proliferation and differentiation of BMSC be controlled by the stretch;3. Whether does the effects of the stretch to the proliferation and differentiation of BMSC be exeisted. The task of this paper mainly focus on the first problem . The rBMSC cells were 10% and 20% stretched. Gene and protein expression were checked in the control group and the strentch group.The changes of the membrane potential are checked after IKCa channel blocking .The results showed that t stretch can promote the expression of IKCa channel. IKCa channels have involved in this control process. Key words: rBMSC，IKCa channel，stretch，expression, activity 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 III 页 目录 1 绪论 1 1.1 课题研究背景 . 1 1.1.1 骨髓间充质干细胞概述 1 1.1.2 IKCa通道介绍 . 1 1.1.3 牵张对 BMSC 的影响 . 2 1.1.4 膜电位与膜电位染料 DiBAC4（3） . 2 1.1.5 RT-PCR 与流式细胞仪 . 4 1.2 研究现状分析 . 6 1.3 课题研究意义 . 7 1.4 本文研究内容 . 8 2 实验试剂及方法 9 2.1 rBMSC 的原代培养 9 2.2 rBMSC 的鉴定 9 2.3 牵张加载 10 2.4 蛋白样品收集与检测 11 2.4.1 样品收集 11 2.4.2 样品检测 11 2.5 基因样品收集与 RT-PCR 14 2.5.1 RNA 提取 14 2.5.2 反转录 14 2.5.3 PCR 与凝胶电泳 15 2.6 膜电位检测 . 16 3 结果与分析 16 3.1 rBMSC 的鉴定 16 3.2 基因检测结果 . 16 3.3 蛋白检测结果 . 17 3.4 膜电位检测 . 18 4 讨论 19 4.1 牵张对于 IKCa 通道表达的影响 19 4.2 IKCa通道阻断后膜电位的变化 19 结论 19 致谢 20 参考文献 21 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 1 页 1 绪论 1.1 课题研究背景 1.1.1 骨髓间充质干细胞概述 骨髓间充质干细胞是骨髓中除造血干细胞外另一类干细胞，来源于中胚层。已经有 大量研究表明，骨髓间充质干细胞具有很强的增殖与分化能力。Friedenstein1最先证实 了骨、软骨以及纤维组织可以由骨髓间充质干细胞分化得到。Pittenger2在 1999 年把从 人髂骨骨髓样本中分离得到的骨髓间充质干细胞诱导分化成骨、软骨和脂肪细胞，可以 得到骨髓间充质干细胞是多潜能干细胞。 Halleux3低密度接种骨髓间充质干细胞， 得到 了 20 多代由单细胞增殖分化的细胞包括成骨细胞、成软骨细胞以及成脂肪细胞，这说 明了了骨髓间充质细胞中具有干细胞特有的自我复制能力和多系分化潜能。因此骨髓间 充质干细胞的多向分化潜能在基因治疗以及器官移植方面都有着很大的应用空间。 1.1.2 IKCa通道介绍 中电导钙离子依赖的钾离子通道是KCNN4或IK1编码的K+通道重要成员， 在19q13 染色体上，它的结构与功能与钙激活钾通道超家族其他成员有一些区别，例如因为没有 连续精氨酸残基从而不具有电压门控特性。IKCal 的电导值一般为 32-39ps，阻断剂有克 霉唑 Clotrimazole 和甲氨蝶呤 Methotrexate，结构上具有 6 个跨膜片段域(S1-S6)，其中 S5-S6 跨膜结构域包含具有 K+选择性的氨基酸序列 GYG，C 末端包含钙调蛋白结合结 构域， 对胞内的钙高度敏感， 并可以被其识别激活而促进信号传递;而亮氨酸拉链结构是 蛋白激酶及酪氨酸磷酸化位点， 在胞内 N 末端具有内质网所识别的信号， 并且参与通道 的组装与转运。 中电导钙离子依赖的钾离子通道在人体内大量存在，主要存在于 T 淋巴细胞、内皮 细胞以及平滑肌细胞。在人体外周组织，如唾液腺、乳腺、气管及脾脏等均有分布，参 与神经递质的释放、神经肌肉接头兴奋的传递、细胞膜电位形成、免疫功能的调节等， 在维持机体正常生理功能及内环境稳态中起积极重要的作用。此外它还参与了血压稳定 性的调节及淋巴细胞的免疫性调节，促进细胞周期进展及细胞的有丝分裂、增殖等。然 而其功能异常表达常常导致多种疾病的发生，甚至促进肿瘤的形成。钙调蛋白及通道磷 酸化相互作用使中电导钙离子依赖的钾离子通道充分激活，诱发细胞膜电位超极化，使 膜内外电化学梯度增加， 促进胞内 Ca2+经钙释放激活钙通道内流， 促进肿瘤细胞的增殖 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 2 页 IKCal;能够增加细胞周期基因蛋白的表达，推动细胞分裂周期向前进程;此外 IKCal 可被 酪氨酸蛋白激酶受体所激活，从而促进 Ras/ERK 等信号传导通路的信息传递。 图 1 IKCa通道结构13 1.1.3 牵张对 BMSC 的影响 骨是一个动态的组织，一直进行不断的重建来保持其结构完整性和代谢活性，而骨 组织新生的细胞学基础是骨髓间充质干细胞能向成骨细胞分化。 Altman 等研究证实， 骨 髓间充质干细胞在力学刺激的作用下能够成骨向分化，经过力学刺激后，骨髓间充质干 细胞的型胶原、型胶原以及 tenascin-cmRNA 表达增加，同时还能提高碱性磷酸酶 活性。 该研究提示力学刺激是促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向分化的一种很重要 的因素。 Qi 等在体外应用四点加力装置证实了机械牵张可以促进间充质干细胞增殖， 增 加碱性磷酸酶活性， 上调 Cbfa-1(Runx2)和Ets-1基因表达。 Kim 等在体外运用静态牵张， 证实了静态牵张在骨形态发生蛋白 2 诱导的 C2C12 多潜能成肌细胞成骨分化过程中能 起到协同作用，静态牵张和形态发生蛋白 2 共同作用，能提高细胞的碱性磷酸酶活性， 上调成骨相关因子的表达。Campisi 等在兔子下颌骨牵张成骨中采用模拟临床的牵张方 式，研究了形态发生蛋白在下颌骨牵张成骨过程中的表达，证实了形态发生蛋白在机械 应力诱导成骨分化中参与了机械应力转化为生物反应的过程。 1.1.4 膜电位与膜电位染料 DiBAC4（3） 膜电位(Membrane Potential)通常是指以膜相隔的两溶液之间产生的电位差。一般是 指细胞生命活动过程中伴随的电现象，存在于细胞膜两侧的电位差。膜电位在神经细胞 通讯的过程中起着重要的作用。 在安静状态时，正电荷位于膜外一侧（膜外电位为正） ，负电荷位于膜内一侧（膜 内电位为负， ）这种状态称为极化。如果膜内外电位差增大，即静息电位的数值向膜内 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 3 页 负值加大的方向变化时，称为超极化。相反地，如果膜内外电位差减小，即膜内电位向 负值减小的方向变化，则称为去极化或极化。静息电位是由于细胞内 K+出膜，膜内带 负电，膜外带正电导致的 。 当细胞受刺激时，在静息电位的基础上可发生电位变化，细胞膜两侧存在离子浓度 差，细胞膜内 K+浓度高于细胞膜外，而细胞外 Na+、Ca2+、Cl-高于细胞内，这种浓度差 的维持依靠离子泵的主动转运。 （主要是 Na+-K+泵的转运） 。 细胞膜在不同状态下对不同 离子的通透性不同，例如，安静时主要允许 K+通透，而去极化到阈电位水平时又主要 允许 Na+通透 当细胞受到刺激时， 导致细胞部分去极化致使 Na+少量内流然后使得去极化至阈电位 水平，Na+内流与去极化形成正反馈（Na+爆发性内流）从而达到 Na+平衡电位（膜内为 正膜外为负）形成了动作电位的上升。当膜去极化达一定电位水平后 Na+内流停止、K+ 迅速外流， 这样就导致了形成动作电位的下降。 动作电位是一种快速， 可逆的电变化， 传播的方式为局部电流，传播速度与细胞直径成正比。产生动作电位的细胞膜将经历一 系列兴奋性的变化：绝对不应期相对不应期超常期低常期，它们与动作电 位各时期的对应关系是：峰电位绝对不应期；负后电位相对不应期和超常期； 正后电位低常期。 动作电位期间Na+、 K+离子的跨膜转运是通过通道蛋白进行的， 通道有开放、关闭、备用三种状态，由当时的膜电位决定，故这种离子通道称为电压门 控的离子通道，而形成静息电位的 K+通道是非门控的离子通道。当膜的某一离子通道 处于失活（关闭）状态时，膜对该离子的通透性为零，同时膜电导就为零（电导与通透 性一致） ，而且不会受刺激而开放，只有通道恢复到备用状态时才可以在特定刺激作用 下开放。 分子式：C27H39N4O6，分子量为 515.62。DiBAC4(3)是一种细胞膜电位敏感的亲脂 性阴离子荧光染料，DIBAC4(3)本身无荧光，当进人细胞与胞浆内的蛋白质结合后才发 出荧光，DIBAC4(3)进入细胞，细胞内荧光强度增加，即膜电位增加表示细胞去极化； 反之，细胞内荧光强度降低即膜电位降低表示细胞超极化。DiBAC4(3)是目前最常用的 线粒体膜电位检测荧光探针。 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 4 页 图 2 DiBAC4(3)结构式 1.1.5 RT-PCR 与流式细胞仪 RT-PCR 是将 RNA 的反转录（RT）和 cDNA 的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的 技术。RT-PCR 是将 RNA 的反转录（RT）和 cDNA 的聚合酶链式扩增（PCR）相结合 的技术。 首先经反转录酶的作用从 RNA 合成 cDNA，再以 cDNA 为模板，扩增合成目的片 段。RT-PCR 技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中 RNA 病 毒的含量和直接克隆特定基因的 cDNA 序列。作为模板的 RNA 可以是总 RNA、mRNA 或体外转录的 RNA 产物。 。RT-PCR 用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术 还可以用来检测基因表达差异或不必构建 cDNA 文库克隆 cDNA。RT-PCR 比其他包括 Northern 印迹、RNase 保护分析、原位杂交及 S1 核酸酶分析在内的 RNA 分析技术，更 灵敏，更易于操作。逆转录反应可以使用逆转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异 性的引物（GSP）起始。RT-PCR 可以一步法或两步法的形式进行。在两步法 RT-PCR 中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA 的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出 1/10 的反应产物进行 PCR。 在一步法 RT-PCR 中， 逆转录和 PCR 在同时为逆转录和 PCR 优化的条件下，在一只管中顺次进行。 流式细胞术（Flow CytoMeter，FCM）是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒 子进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞 中测得多个参数，与传统的荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点， 成为当代最先进的细胞定量分析技术。 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞 的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出， 鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度， 这样， 鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行 排列，依次通过检测区域。 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 5 页 流式细胞仪通常以激光作为发光源。 经过聚焦整形后的光束， 垂直照射在样品流上， 被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向 光电二极管和 90 方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信 号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色 性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。 这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度， 经光 电倍增管接收后可转换为电信号， 再通过模/数转换器， 将连续的电信号转换为可被计算 机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在 计算机屏幕上，液可以打印出来，还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询 或进一步分析。 检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形 式表达，其 X 轴为测量强度，Y 轴为细胞数目。一般来说，流式细胞仪坐标轴的分辨率 有 512 或 1024 通道数，这视其模数转换器的分辨率而定。对于双参数或多参数数据， 既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三 维立体视图。 细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超 高频电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测定细胞就分散在这些 液滴之中。将这些液滴充以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏特的偏转板时，在 高压电场的作用下偏转， 落入各自的收集容器中， 不予充电的液滴落入中间的废液容器， 从而实现细胞的分离。 流式细胞仪的应用很广泛，主要有一下几个方面： 细胞生物学：定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞；分析生物大分子 如 DNA、RNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系，进行染色体核 型分析，并可纯化 X 或 Y 染色体。 肿瘤学：DNA 倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的特异指标。近年来已应用 DNA 倍体测定技术，对白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探 测。用单克降抗体技术清除血液中的肿瘤细胞。 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 6 页 免疫学：研究细胞周期或 DNA 倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系；进行免疫 活性细胞的分型与纯化； 分析淋巴细胞亚群与疾病的关系； 免疫缺陷病如艾滋病的诊断； 器官移植后的免疫学监测等。 血液学：血液细胞的分类、分型，造血细胞分化的研究，血细胞中各种酶的定量分 析，如过氧化物酶、非特异性酯酶等；用 NBT 及 DNA 双染色法可研究白血病细胞分化 成熟与细胞增殖周期变化的关系，检测母体血液中 Rh(+)或抗 D 抗原阳性细胞，以了解 胎儿是否可能因 Rh 血型不合而发生严重溶血；检测血液中循环免疫复合物可以诊断自 身免疫性疾病，如红斑狼疮等。 药物学：检测药物在细胞中的分布，研究药的作用机制，亦可用于筛选新药，如 化疗药物对肿瘤的凋亡机制，可通过测 DNA 凋亡峰，Bcl-2 凋亡调节蛋白等。 1.2 研究现状分析 骨髓间充质干细胞(BMSCs)在一定的诱导条件下,BMSCs 具有向成骨细胞、 脂肪细胞、 骨骼肌、软骨细胞、平滑肌、肌腱细胞、造血支持基质等中胚层细胞分化的能力;同时可 以向外胚层的星形胶质细胞、神经元、血管内皮细胞和心肌细胞分化。BMSCs 跨系、 甚至跨胚层横向分化的可塑性及其强大的分化潜能使得它可为组织修复提供可能性。 Kinnaird 等认为,干细胞可能通过旁分泌的机制来促使 缺血局部的血管生长。 在实验 中发现,间充质干细胞在缺氧条件下,一系列有关血管生成的细胞因子的表达上调且分泌 在培养基中。内皮细胞和平滑肌细胞的增生在这种培养基中被加强。而当这些培养基注 射进动物的后肢缺血部位后,加速了缺血区的侧枝建立,改善了局部功能,降低了肌肉萎缩。 Ziegelhoeffer 等在给后肢缺血动物模型注射 GFP 阳性干细 胞后,没有发现表达内皮或平 滑肌细胞标记的GFP阳性细胞,但在新生血管周围有大量GFP阳性细胞,而且一些生长因 子染色阳性。在这个实验中还发现,在普通显微镜下呈现内皮或平滑肌细胞标记阳性的 GFP 阳性细胞,实际上是一种假阳性现象。当用激光扫描共聚焦显微镜观察时,发现这种 阳性细胞实际上是两类细胞,一类表现内皮或平滑肌细胞标记阳性,另一类为 GFP 阳性细 胞。很明显,一些结果之间差别很大,甚至是相互矛盾的。出现这样的情况可能有几种原 因:(1)一般实验是将干细胞提取、体外培养后再注射到机体内。这个过程中,干细胞所处 的人为环境和机体内环境相差很大,这就可能导致干细胞的生理功能受到影响,发生干细 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 7 页 胞的分化,甚至失去分化的能力;(2)由于干细胞的数量很少,而且间充质干细胞并没有很 特异的标志.这样就有可能导致提取的干细胞纯度不高,从而导致实验结果出现误差;(3) 一些研究表明,干细胞在不同的器官或组织以及在不同的损伤中可能有不同的表现。 也就 是说,干细胞完全有可能在不同的情况下表现出不同的分化方向。 目前组织工程中细胞移植成为重要研究内容,其中 BMSCs 是继造血干细胞、胚胎干 细胞后的又一研究热点。BMSCs 是比较原始的细胞,可被定向诱导分化为临床所需的多 种组织细胞。可取自自体骨髓,取材方便,且体外易培养,增殖快。并且由于来源于自 体,BMSCs 免疫原性较弱,能够抑制混合淋巴细胞反应,由它诱导而来的组织在进行移植 时不存在组织配型及免疫排斥等问题,亦不涉及伦理道德问题,因此通过体外培养扩增后 的 BMSCs 是组织工程中理想的种子细胞。异体 BMSCs 注射到异染性脑白质营养不良 患者发现没有反应性异常的 T 细胞出现和 GVHD 发生，异体移植骨髓 MSCs 在重度特 发性再生障碍性贫血患者中植活也被证明,具有改善骨髓基质功能的作用。 1.3 课题研究意义 由于骨髓间充质干细胞取材方便，且由它分化来的组织细胞进行自体移植重建组织 器官的结构和功能时不存在组织配型和免疫排斥的问题，且通过自体骨髓间充质干细胞 移植不仅可以在短期内改善患者的临床症状，更为重要的是可以提高远期临床疗效、减 少病情反复的几率， 甚至达到治愈的目的。 因此它在组织工程创伤修复、 细胞替代治疗、 基因治疗等方面具有很好的临床应用价值和广阔的应用前景。但是直到目前为止， BMSCs 的分离、 纯化及扩增方法还不够完善； 还未建立鉴定 BMSCs 的统一标准； BMSCs 在体内的细胞生物学和分子生物学作用机制尚不清楚，BMSCs 广泛应用于临床还有许 多问题亟待解决：比如 BMSCs 移植时机、移植路径，移植细胞的成分、数量以及移植 后的细胞能否长期存活，移植后是否产生无法控制的细胞分化增殖，细胞移植后是否具 有致瘤性，如何限定 BMSCs 在体内外诱导条件下向所需细胞、组织定向分化等等诸多 问题。相信随着这些难题的解决，人类就可以通过有效控制 BMSCs 在体内的生物学行 为，在医学领域中达到特异性和预期性的治疗目的。 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 8 页 1.4 本文研究内容 图 3 实验流程 本课题内容主要包括： （1） 完成 rBMSC 的原代培养及鉴定： （2） 牵张加载以及加载后IKCa通道表达的检测： 用10%和20%两种牵张强度对rBMSC 进行牵张加载 24h。收到的样品进行 2 个方面的检测，蛋白检测与基因检测。 （3） 添加 IKCa通道特异性阻断剂 TRAM-34， 检测阻断后膜电位的变化以确定 IKCa通 道是否参与了这个过程。 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 9 页 2 实验试剂及方法 2.1 rBMSC 的原代培养 手术取大鼠骨髓间充质干细胞： 1. 购买 4 周龄 SD 雄性大鼠，准备好手术剪，手术钳等； 2. 引颈处死大鼠，酒精棉擦拭大鼠腿部以消毒，用手术剪剪出大鼠腿部，注意对骨关 节的保护，尽量截下完整关节以防止暴露骨髓腔污染细胞，剥皮削肉取出完整的股 骨； 3. 在超净台中将股骨放在 75%酒精中浸泡 3-5min，骨钳夹去两端骨关节，用无菌注射 器吸取添加了 10%血清的低糖 DMEM 培养液冲刷骨髓腔直至无血色； 4. 冲洗后的混合液过 200 目滤网，在 50ml 离心管中 1000rpm 离心 5min； 5. 弃去上清加入 10%低糖 DMEM6.66ml， 吹打悬起加入等体积 percoll 工作液 6.66ml。 注意最好是悬起的细胞滴入到 percoll 工作液中，越缓慢越好。 Percoll 工作液配置：20ml 贮存液+13.3ml 1PBS Percoll 贮存液：18ml 购买的 percoll 液+2ml 10PBS 6. 1500-2000rpm 离心 8-10min，弃去上层红色部分，把中间云雾状细胞团吸入到 15ml 离心管中。1PBS 冲洗，1000rpm 离心 3min，重复洗一次； 7. 弃去上清加入 10%低糖 DMEM 混匀，平均分配到 2 个培养皿中。3 天后换液，长满 后传代（前 2 次消化不要太彻底，不易消化的细胞弃去） PBS 配制： NaCl 8g KCl 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g 称量好后溶于 1000ml 超纯水，调节 pH 至 7.4，12620min 高压灭菌，4保存。 2.2 rBMSC 的鉴定 根据 rBMSC 表面表达 CD29、CD44、CD90、CD66、CD105 等，不表达 CD45、 CD34、CD14 or CD11b、CD79a or CD19、HLA-DR 等，可以用免疫荧光鉴定。 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 10 页 实验前，将细胞接入 24 孔板中。 待细胞汇合度达到 70左右开始进行染色步骤。 1. 用配制的 4%多聚甲醛过夜固定； 4%多聚甲醛配制：用电子分析天平称取 4g 多聚甲醛，置于 1000ml 烧杯中。量取 996ml 蒸馏水， 加入烧杯中。 烧杯置于电加热的磁力搅拌器上， 调整好预设温度 60、 转速 1300r/min，操作要在通风橱中进行。加热搅拌 1.5h 左右，温度上升到预先设 定的 60，液体逐渐变成透明时，即可关闭加热搅拌器。待液体冷却后，倒入事先 准备好的玻璃容器中，密封保存于 4的冰箱中。整个加热过程，要尽量避免身体 直接接触甲醛溶液，操作均在通风橱中进行。 2. PBS 洗三遍 ； 3. 用 0.2% triton X-100（按照体积比 0.2ml+100mlPBS 配制）对细胞透化破膜处理 10 分钟； 4. PBS 再洗三遍； 5. 0.1%BSA 封闭 30 分钟（时间越长越好） ； 6. PBS 洗三遍 ； 7. 加入一抗，室温孵育 1 小时； 8. PBS 洗三遍； 9. 加入二抗，室温避光孵育 30-45 分钟； 10. PBS 洗三遍，尽量洗去背景 ； 11. 加入 0.5 ug/ml DAPI（PBS 配制）染色 10 分钟； 12. 用 PBS 洗三遍，去除多余的 DAPI； 13. 荧光显微镜下观察染色情况。 2.3 牵张加载 将清洗好泡在酒精内的硅弹性模铺在方板内，用紫外清洗机紫外消毒 30min，处理 好后移到超净台内，打开盖子，超净台紫外照射 30min。 在硅弹性膜上铺上过滤好的多聚赖氨酸，37培养箱孵育 2h 后吸去多余的多聚赖 氨酸。将培养皿内的 rBMSC 细胞用胰酶消化后离心，留取沉淀加入添加 10%血清的低 糖 DMEM，将带有细胞的培养基接种到方板内（一般方板加 15ml 的培养基） 。 等待细胞完全贴附后，将硅弹性模固定在拉伸装置上，施加 10%与 20%牵张。24h 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 11 页 后可以收集样品。 硅弹性膜的洗涤： 将膜置于大烧杯中， 加入一蒸水以及洗涤剂 （中性） ， 超声 30min， 一蒸水冲洗三次，加入超纯水超声 30min，重复 3-5 次，75%酒精浸泡保存。 2.4 蛋白样品收集与检测 2.4.1 样品收集 因为流式蛋白检测需要的细胞数目比较多，所以接种细胞时要注意细胞密度，蛋白 样品用胰酶收取。 1. 用镊子将方板中的硅弹性膜取出来，PBS 洗净，在硅弹性膜上滴加胰蛋白酶，显微 镜下观察等细胞都消化下来后析出液体，PBS 洗一遍，离心弃去上清，沉淀用 PBS 洗三次（加 PBS 离心，反复三次） ，加入 500ul 的 4%多聚甲醛固定。 2. PBS 洗三次（反复离心去上清） ； 3. Triton-100 破膜 10min，PBS 洗三次； 4. 加入 KCNN4（兔源 IKCa抗体）孵育 50min，PBS 洗三次； 5. 加入山羊抗兔的二抗避光孵育 30min，PBS 再洗三次； 6. 将离心得到的沉淀加入 300ul 的 PBS 置于试管中； 7. 上流式细胞仪检测 注意：因为反复的 PBS 清洗步骤，一定要注意对细胞的保护，尽量不要吸到沉淀，否则 很容易造成流式细胞数目的不足。 2.4.2 样品检测 1. Calibur 开机：先开启细胞仪本体再打开计算机。仪器会对鞘流液筒打气加压，确认 筒盖确实旋紧。 将减压阀方向调在加压（向前）位置。减压阀如在 VENT 位置， 按 RUN 功能键时将显示橙黄色，正常为绿色显示。 2. 开启 CellQuest 软件、编辑实验文件:在苹果菜单下点击 CELLQuest 启动软件。桌 面会出现一 Untitled 实验文件，可点击实验文件的右上角的放大钮，将实验文件窗 口放大。 从工具板中点击散点图图示。在实验文件的空白区点击，拖曳对角线至 适当大小，然后放开鼠标。出现散点图对话方框。在出现的散点图对话方框中点击 Plot Source， 选择 Acquisition (收取) ， 确认 X 和 Y 轴参数预设为 FSC-H 1024、 SSC-H 1024。在颜色方框中点击 Multicolor Gating（收取样品时，门内细胞将出现颜色）点 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 12 页 击 OK。此时实验文件会出现 FSC/SSC 散点图 。Plots 菜单中选择 Dot Plot 功能， 可复制一个同样大小的散点图， 在出现的对话方框内选择 X 轴： FL1-H 1024， Y 轴： FL2-H 1024。点击 OK，FL1/FL2 的散点图出现。完成后可将重制图移至原图右方。 在工具板中选择四象限工具， 在 FL1/FL2 散点图上拖动 Quadrant 的中心将它设定在 （x，y）（101，101）处，这些象限将指定阴性/阳性区域建立仪器和计算机之间 通讯:从Acquire菜单中选择Connect to Cytometer， 此时会出现Acquisition Control 对 话方框。检查现有仪器条件，从 Cytometer 菜单中选择 Detectors/Amps。出现 Detectors/Amps 窗口。 在 Detectors/Amps 窗口确认 FSC 与 SSC 为 LIN （线性放大） ， 其它FL1-3为 LOG （对数放大） ， 将其拖至空白区。 从 Cytometer菜单中选择 Threshold， 出现 Threshold 窗口在 Threshold 窗口，确认 FSC 为设阈参数，初步确认预设阈值 52。将其拖至空白区。从 Cytometer 菜单中选择 Compensation，确认所有预设数值 皆为零。将其拖至空白区。 3. 上样品、设置仪器:使仪器处于 High RUN，支撑架左移，上阴性对照管样品，支撑 架回位。 确认Acquisition Control 窗口中前需打叉或打勾 (即不储存数据)， 点击 Acquire。 观察 FSC/SSC 图的变化。 FSC 电压(Voltage)预设为 E00， 可调节 Amp Gain 从 1.009.99 使主要细胞群得以清楚显示（如细胞较大，将 FSC 电压设置于 E-1；较小细胞，将 FSC 电压设置于 E01） 。调节 SSC 电压使主要细胞群得以清楚呈 现。调节 FSC/SSC 图的原则，在于能得到一独立离散的细胞族群，该细胞群不与其 它族群、 细胞碎片有重迭现象。 调整定位后， 点击 Acquisition Control 窗口中的 Pause。 4. Gating 圈选 ：在工具板中选择多边形的 Region，在 FSC/SSC 散点图上划定区域。 分析样品时， 区域内细胞应会呈现成红色， 可移动或改变形状来圈选有意义的细胞。 如果要删除R1区域， 您可以在工具栏中点选Gates Region list ， 以鼠标点选 R1， 再按 Delete 键删除 R1 区域。删除 R1 区域后，可用绘图工具板，重画 R1。选取希 望Gate的FL1/FL2散点图， 从Plots菜单中选择Format dot plot。 在出现对话方框内， 将 No Gate 改选 G1=R1，点击 OK。 5. 2.4.6 调节 FL1、FL2 的探测器（电压） ：点击 Acquisition Control 窗口中的 Restart。 在 Detector/Amps 窗口中调节 FL1、FL2 的电压，使 Negative Control 细胞群着落在 所选直方图或散点图之 100-101处。在 Threshold 窗口，适当地提高 FSC 阈值52， 以去除碎片或低阶噪音。注意不要切掉主要细胞族群。点击 Acquisition Control 窗 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 13 页 口中的 Pause、Abort。移去阴性对照管，关闭 Detector/Amps、