具有缓释功能的鱼胶原诱导再生膜的制备及表征

单位代码 10006 学 号 10101015 1分类号 R318.08 毕业设计(论文)具有缓释功能的鱼胶原诱导再生膜的制备及表征 学院名称生物与医学工程学院 专业名称生物工程 学生姓名吴哲 指导教师周钢 2014 年 6月 论文封面书脊具有缓释功能的鱼胶原诱导再生膜的制备及表征吴哲 北京航空航天大学 北京航空航天大学本科生毕业设计（论文）任务书、毕业设计（论文）题目： 具有缓释功能的鱼胶原诱导再生膜的制备及表征 、毕业设计（论文）使用的原始资料（数据）及设计技术要求： 确保原始数据的真实性,不违背学术要求及道德底线.在本实验中使用的大部分原始资料及数据为扫描电镜下图片分析、IR红外光谱分析以及分光光度计对体外缓释进行检测。 本实验设计的实验技术有：具有缓释功能的微球囊的制备，鱼胶原诱导再生膜的冷冻干燥，红外光谱检测特征峰，扫描电镜等。 、毕业设计（论文）工作内容：1月20日-3月2日 文献调研 3月2日-3月15日 鱼胶原诱导再生膜制备的预实验 3月15日-3月20日 鱼胶原诱导再生膜的制备和表征 3月20日-4月1日 具有缓释功能的微球囊制备的预实验 4月1日- 4月20日 具有缓释功能的微球囊的制备和表征 4月20日- 5月10日微球囊与胶原诱导再生膜的复合及表征 5月10日- 6月5日 数据分析处理，完成实验报告的书写，准备答辩 、主要参考资料：1 E.H.Groeneveld, J.P.Van den Bergh, P. Holzmann, C.M. Bruggenkate, D.B. Tuinzing,E.H. Burger, Mineralization processes in demineralized bone matrix grafts in human maxillary sinus floor elevationsJ. Biomed. Mater. Res. 1999: 393402. 2 W. Suchanek, M. Yoshimura, Processing and properties of hydroxyapatite-based biomaterials for use as hard tissue replacementJ. Mater. Res.1998:94117.3 K.A. Hing, S.M. Best, K.E. Tanner, W. Bonfield, Quantification of bone in growth within bone-derived porous hydroxyapatite implants of varying densityJ. Mater.Sci. Mater. Med. 1999:663670.4 D.M. Liu, Fabrication and characterization of porous hydroxyapatite granules,Biomaterials 1996:19551957.5 S.H. Li, J.R. Wijn, P. Layrolle, K. de Groot, Synthesis of macroporous hydroxyapatite scaffolds for bone tissue engineeringJ. Biomed. Mater. Res. 2002:109120.6 l. Kong, Y. Gao,W. Gao, Y. Gong, N. Zhao, X. Zhao, Preparation and characterization of nano-hydroxyapatite/chitosan composite scaffoldJ. Biomed. Mater. Res. 2005:275282.7 L. Wang, Y. Li, Y. Zuo, L. Zhang, Q. Zou, L. Cheng, H. Jiang, Porous bioactive scaffold of aliphatic polyurethane and hydroxyapatite for tissue regeneration, Biomed.Mater.2009: 17.8 G. Wei, G.P. Ma,Structure and properties of nano-hydrocyapatite/polymer composite scaffolds for bone tissue engineering,Biomaterials 2004:47494757.9 Y.C. Fu, H. Nie, M.L. Ho, C.K. Wang, C.H. Wang, Optimized bone regeneration basedon sustained release from three-dimensional fibrous PLGA/Hap composite scaffolds loaded with BMP-2, Biotechn. Bioeng. 2008: 9961006. 生物与医学工程学院 学院 生物工程 专业类 101011 班学生 吴哲 毕业设计（论文）时间： 2014 年 3 月 1 日至 2014 年 6 月 1 日答辩时间： 年 月 日成 绩： 指导教师： 周钢 兼职教师或答疑教师（并指出所负责部分）： 系（教研室） 主任（签字）： 注：任务书应该附在已完成的毕业设计（论文）的首页。北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 2 页 北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 1 页 本人声明我声明，本论文及其研究工作是由本人在导师指导下独立完成的，在完成论文时所利用的一切资料均已在参考文献中列出。 作者：吴哲签字：时间：2014年6月北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 III 页 具有缓释功能的鱼胶原诱导再生膜的制备及表征 学 生：吴哲 指导教师：周钢摘 要近年以来已经有多种药物实现了以壳聚糖微球作为缓释载体，在生物医学领域展现了良好的应用前景，成为缓控缓释剂研究的热点之一。本实验以壳聚糖微球作为药物缓释载体，并将其与鱼胶原诱导再生膜复合，以达到提高诱导再生膜性能的目的。本实验以壳聚糖溶液为水相、液体石蜡为油相形成“油包水”型乳液，以香草醛为交联剂， 采用乳化交联法制得壳聚糖微球；本实验自行从废弃的鱼鳞中提取鱼胶原，采用的办法是闪式提取法和酸溶盐析法。再通过冷冻真空干燥的办法将壳聚糖微球与鱼胶原诱导再生膜结合起来。通过红外光谱检测和扫描式电子显微镜来对二者的结合情况进行分析。红外光谱检测显示出与壳聚糖微球复合之后的诱导再生膜显示出了两者的特征峰，扫描式电子显微镜观察结果显示, 载药微球表面致密且球形度好, 微球粒径在520m之间，并观察到壳聚糖微球和胶原诱导再生膜之间很好的结合。此外，采用分光光度计对载有巴萨药物的复合诱导再生膜进行体外缓释检测，检测结果表明复合诱导再生膜缓释效果明显。关键词：壳聚糖，鱼胶原，药物缓释，诱导再生膜Preparation and characterization of fish collagen regeneration membrane with slow-release functionAuthor : WU Zhe Tutor : ZHOU GangAbstractIn recent years there have been a variety of drugs that achieve a sustained release with chitosan microspheres as carriers which show a good prospect to become one of the hot slow controlled release formulation studies in the biomedical field. In this study, chitosan microspheres as drug delivery works with fish collagen regeneration membrane in order to improve the ability of membrane. In this experiment, the chitosan solution as the aqueous phase , liquid paraffin oil phase to form a water in oil , and the method of crosslinking emulsion were using to chitosan microspheres . the experiment obtains the fish collagen from fish scales abandoned , the method is flash extraction and acid salting . And then freeze-dried to mix the chitosan microspheres with fish collagen regeneration membrane together. To analyze the situation of these two by infrared spectroscopy and scanning electron microscopy . Infrared spectroscopy showed the addition of chitosan microspheres after regeneration membrane complex showed characteristic peaks , scanning electron microscopy results both show that the surface of microspheres dense and good sphericity . Particle size microspheres is between 5 20m, and we can observed that chitosan microspheres and collagen-induced regeneration good combination between the membranes. In addition , using a spectrophotometer to value the level of Bsa in composite membrane in vitro -release testing, test results showed that the composite membrane has the function of slow-release effect.Key words：chitosan, collagen, slow-release effect, regeneration membrane目 录1绪论11.1研究意义11.2研究现状分析12研究方案72.1研究目标72.2研究内容72.3基本原理82.4研究方案103实验步骤123.1从鱼鳞中提取鱼胶原作为制备骨诱导再生膜的原材料123.2壳聚糖载药微球的制备123.3FTIR-650傅里叶红外光谱分析仪操作步骤133.4扫描式电子显微镜操作步骤133.5Unico7200紫外可见分光光度计使用步骤143.6JY-82C视频接触角测量仪操作步骤144实验结果与分析154.1红外光谱分析154.2扫描式电子显微镜观察224.3接触角测量294.4复合微球囊后诱导再生膜的缓释功能的体外检测30结论33致谢34参考文献35北京航空航天大学毕业设计(论文) 第 37 页 1 绪论1.1 研究意义人体的颌骨尤其是牙槽骨是人体的骨骼中最活跃的部分，当一个正畸力传递至牙槽骨时，受压侧牙槽骨吸收，张力侧牙槽骨增生，不断的进行着更新和改建，从而产生所需的牙齿移动，并且在新的位置上建立新的平衡1。外伤、肿瘤、囊肿、正畸等多种因素常会导致牙槽骨缺损，牙种植手术中经常会遇到牙槽骨骨量不足的问题，这会使牙种植手术的效果受到限制,目前解决的方法不多，主要有两种：一种是将填充材料充填到牙槽受损处，从而诱导骨再生，但修复后的牙槽骨是否影响牙齿的移动以及可能影响的程度，现在报道的研究甚少，而这对缺损牙槽骨修复后的错位和畸形矫正是很重要的；另一种是运用生物医学中组织工程原理诱导组织再生，诱导牙周组织中的成骨细胞增殖与分化参与再生过程，该过程叫做骨诱导再生过程，应用技术为骨诱导再生技术（GBR）1-2。GBR技术应用的关键是手术中使用的骨诱导再生膜材料的选择。目前得到广泛应用的诱导再生膜材料主要有金属钛膜和胶原膜：钛膜降解性差，胶原大多源于哺乳动物，应用范围受限，且钛膜和常用胶原膜成本昂贵，给病患造成了很高的经济负担，因此，能够制备一种成本低廉，治疗效果优异的骨诱导再生膜材料是具有重要意义的科研课题2。另外,诸如增长因子、酶以及诸如细胞因子等许多蛋白质类药物对于组织再生都是必需的，并且这些细胞因子和蛋白质都具有强效针对性且具体的治疗或修复效果；然而，蛋白质类药物对于组织破坏或修复是非常脆弱的，导致经常出现失去了生物活性的情况出现；这就需要具有更好的蛋白质兼容性的药物输送装置3。因此,研制出一种既具有缓释药物功能又具有良好的生物相容性和诱导组织再生能力的药物传输系统具有广阔的发展前景4。1.2 研究现状分析1.2.1关于诱导再生膜的材料选择目前，越来越多的学者致力于将骨诱导再生技术原理应用于临床实践,但是由于所应用的屏障膜的性能的不同，往往各研究报道创口愈合，组织再生程度存在一定的差异5。通过研究总结包括651例垂直型骨缺损的17项骨诱导再生技术临床研究报道指出：在651例垂直型骨缺损的病例中，骨诱导再生手术术后一年发生附着丧失的病例约占2.7%，临床附着获得量少于2mm者为11%，附着获得在23mm之间的为24.8%，附着获得超过6mm者为21.2%；一些报道显示根分歧病变在骨诱导再生手术术后一年的组织再生程度也存在同样的差异,故为了进一步提高引导牙周组织再生术的临床疗效，辨明并控制影响其临床效果的各方面因素，具有一定的临床指导意义,在骨诱导再生技术中，已经发现的其影响因素主要包括适应症的选择，手术方法的确定，膜的选择与使用等几个方面，其中，膜的选择是最为关键的5。近年来，国内科研人员经过探讨和实验，应用进口的Bio-gide生物膜通过骨诱导再生技术来增加牙槽骨量，取得了较好的效果（图1.1）,但是进口生物膜的成本很高，在膜形状为25mm*25mm时售价为1400元人民币，给患者增加了非常重的经济负担6。瑞士Geistlich公司生产的Bio-gide可以说是牙槽骨再生膜材料的生产的垄断公司，如果这种情况得不到改善，对于需要骨再生膜材料治疗的患者来说，在经济上无疑是非常被动的,因此，我国急需国产生物膜引导骨再生技术增加牙种植床的骨量7。图1. 1 瑞士Geistlich公司生产的Bio-gide膜牙槽骨诱导再生膜的必须具有优秀的屏障功能，并且能够为细胞提供粘附位点，进而增殖和分化,研究表明，“致密层-多孔层”的结构设计是最为科学合理的9。膜的致密层可以阻挡细胞并防止细胞长入，一方面，阻挡非成骨细胞向植骨区域生长，另一方面，允许成纤维细胞沿着胶原纤维附着;而膜的另外一层，多孔的网状排列的胶原纤维利于成骨细胞融合入三维的框架结构，从而支持骨的再生.同时,框架结构中可以负载上具有缓释功能的微球囊从而可以达到药物的运输和缓释的目的,对于双层结构的膜材料来说，不同的层被不同的细胞所占据;在多孔层一侧，细胞可以轻易地穿入胶原框架并在那里沿着光滑面生长10。较高的亲水性是牙槽骨诱导再生膜的另一个重要特性。现有研究指出，材料的亲水性可以对成骨细胞的粘附、铺展行为和黏着斑激酶（FAK）表达造成影响。通过一系列的科学研究已经证明，亲水性高的材料表面可以明显增强成骨细胞在材料表面的粘附，能够促进细胞骨架沿一定方向伸展，促进FAK的表达，从而综合提高成骨细胞的生长和分化能力4-5。牙周结缔组织中I型胶原最多，因此引导组织再生胶原膜应该以I型胶原作为其主要成分,I型胶原材料具有无抗原性、生物相容性好、能促进细胞增殖、加快伤口愈合、降解产物无毒副作用等优点,随着生物医学材料产业和组织工程学的兴起，它作为牙周组织工程的支架材料而倍受关注,在骨诱导再生膜制备材料的选择上，与金属材料（钛膜）相比，胶原也有非常突出的优势：首先，钛膜是不可吸收膜，质硬，有一定的抗力强度，有利于空间维持，但是光滑的表面也不利软组织的附着，易伤口裂开暴露。而胶原膜是可吸收膜，由纤维状的胶原构成，具有良好的组织相容性，其抗张强度和弹性较高，免疫原性较低，在提供细胞屏蔽作用的同时，可完全降解，逐渐与周围组织融为一体并在新骨形成后逐渐吸收，勿需二次手术取出；其次，钛膜的结构上无任何孔隙，限制了血液血浆进入植骨区，胶原膜通透性好，可允许血浆渗入膜下，保证膜下植入物的营养。最后，钛膜的手术处理非常繁琐，钛膜暴露时，要尽量保持局部清洁，于组织瓣下注入派力奥，全身抗炎治疗，防止继发感染 如果保持2个月以上未发生感染，可以拆除钛膜，这时对骨再生效果不会造成严重影响11-12。如果发生感染，则应及时拆除钛膜。胶原膜暴露时，对膜的暴露部分不能冲洗、擦拭，告知患者进食和清洁口腔时不要触碰膜的暴露部分，一般可自行愈合，不需处理;与钛膜相比，生物胶原膜能有效地屏蔽软组织，引导骨再生，重建才槽骨外形，骨整合成功率无显著差异，不需二次手术取出，在临床操作上也更为简便易用，值得广泛应用推广13。目前，胶原在医学上应用的主要来源是陆地动物源性胶原蛋白，如来自人的尸体和胎盘等。目前常用的胶原材料存在以下几方面的问题：易造成动物源疾病，由于人和哺乳动物同源性很高，故易造成人畜共患病，如疯牛病、口蹄疫和禽流感等；或者造成人体传染病的传染风险，如病毒性肝炎和艾滋病等； 源自哺乳动物的胶原蛋白，如猪胶原、牛胶原，由于宗教和文化问题，引起了一些宗教组织对其医学应用的反对；陆地来源有限，为避免感染要通过复杂的过程提取，故已经投入市场的胶原蛋白材料成本很高，同时售价高昂14。水生生物医用材料是生物医用材料和生物技术的重要组成部分，鱼类中提取胶原蛋白相对从陆地动物中提取胶原蛋白具有以下优势：具有较高的生物安全性，对比陆地哺乳动物，从水生生物中提取的生物大分子有效避免了陆地动物疾病病毒传播的风险； 不存在文化宗教问题，可以在医学材料方面广泛应用；成本低廉：原料多为水产品加工行业的下脚料，生产加工成本相对低廉，产品附加值高，为低碳、绿色经营模式提供了一条时间途径，我们注意到，生活生产中产生大量废弃的鱼鳞严重污染了环境，而鱼鳞中胶原蛋白含量可高达55%，因此利用废弃鱼鳞提取大量的鱼胶原蛋白，有效解决鱼鳞环境污染并进行了废物利用15。鱼胶原蛋白是一种具有三螺旋结构的天然高分子化合物，在医药、食品、日用化工、生物医用材料存在巨大应用潜力；鱼胶原蛋白可以作为人工皮肤、人工食道以及气管、烧伤保护膜、可降解手术缝线、止血海绵、缓释药物载体、优良的止血材料等生物医用材料，但是鱼胶原的使用并不如陆地生动物的胶原蛋白的使用常见11-12。对鱼胶原进行初步的结构分析，发现鱼胶原蛋白主要含有I型胶原蛋白，分布在鱼类的皮、骨、鳞等处，是有3条肽链拧成的螺旋形纤维状蛋白质；由于水生生态环境的特殊性（如高压、低温等），使得鱼胶原蛋白在氨基酸的序列上与陆生动物胶原蛋白有较为独特的物化特性；鱼胶原蛋白易溶于中性盐溶液或稀酸，较易调制成可溶性胶原溶液，由于其鱼胶原蛋白低抗原性的特点，使其在医疗和食品领域中更是受到人们欢迎13。用鱼胶原作为骨诱导再生膜的制备材料，一方面能够克服已应用的材料的不足，另一方面具有极强的可塑性，能够塑造成如图1.2所示的“致密层-多孔层”双层结构的诱导再生膜结构，同时具有良好的生物相容性与较高的亲水性；从鱼鳞中提取的鱼胶原是一种天然的，未经化学交联处理的胶原膜，它同时具备操作简便以及治疗安全的特性，因此，使用鱼胶原作为原材料制备骨诱导再生膜具有可实现性，本研究选取的提取方式是从废弃的鱼鳞中提取鱼胶原，变废为宝复合绿色实验的实验要求，再加上可忽略不计的成本和广阔的来源，这种绿色环保的试验方法有着更深层次的潜力和发展空间3-4。图 1.2 诱导再生膜的双层结构示意图1.2.2关于缓释药物的研究进展目前，胶原、明胶、白蛋白、透明质酸等自然生物原料都广泛地应用于缓释类型的药物输送，应用自然生物原料制造可控药物输送系统的主要优点就是它们比合成聚合物更具有极好的诱导骨再生的能力，在多种自然聚合物中，胶原作为一种主要的结缔组织蛋白，展现出了它极高的生物兼容性，I型胶原是一种三重螺旋肽分子，它可以聚集成纤维，并且它在胶原酶的作用下具有生物可降解性，但是，由于胶原的低机械稳定性和形状稳定性，现在的研究中并没有可以将胶原直接作为药物输送载体的制备材料，另外，用胶原来进行蛋白质类药物输送系统的制备所面临的最主要挑战就是，过于开放的网状结构使得在基体中保留封装蛋白质不易进行，因此必须找出固定封装药物的办法13。为了控制蛋白质类药物的输送，许多方法被应用过，最常用的方法就是化学交联，比如使用戊二醛，然而，戊二醛的使用破坏了化学交联结构的生物兼容性，因为有毒残留物和分解产物会在相当程度上加剧细胞毒性和钙化12-13。因为化学交联的弊端日益趋于明显，其他的封装交联方法的需求在日益提升，近年来，微球类药物输送系统得到了越来越多的关注，因为它们可注射，并且能够输送多种药物，基于微球类药物输送系统的优势明显，许多生物分解合成高分子聚合物都被用来制备可控制药物输送系统，为了适应特殊需要，这些材料是可以进行靶点和针对性的调整的，然而，这些原料都有其固有的缺点，除了在制备过程中因将封装药物暴露在有机溶剂和不适宜条件下而产生的破坏药物生物活性的缺点之外，还有与其疏水性和酸性分解产物有关的蛋白质兼容性和稳定性问题15。本实验拟采用壳聚糖作为缓释药物的微球类基础材料,壳聚糖(Chitosan)是一种天然的带正电荷多糖，甲壳素脱乙酰基的产物, 无毒、无刺激性、无致敏性、无致突变作用、无溶血效应，具有良好的生物降解性、生物相容性、生物粘附性和促进药物吸收的作用, 可作为化学药物、多肽、蛋白质药物以及基因药物的载体15 ,壳聚糖载药微球因具有药物控释、组织靶向、提高药物稳定性等多方面优势, 因而已成为近年来新型给药系统研究的热点2-4。目前壳聚糖微球的常用制备方法是乳化交联法，可以制备包埋多种药物的载药微球, 微球粒径较小且球形度好, 制备工艺简单易行, 尤其是可望通过调控交联程度来控制药物释放速率6。将壳聚糖制成载药微球, 能够控制药物释放速度, 降低药物的毒副作用, 提高疏水性药物对细胞膜的通透性, 改善药物的稳定性和改变给药途径, 延长药物疗效, 以及靶向给药等,近年来已有多种药物, 如吲哚美辛、阿司匹林、塞来昔布、盐酸小檗碱、5-氟尿嘧啶、顺铂、维生素E、胰岛素等均实现了以壳聚糖微球作为缓释控释载体, 并实现了在胃、结肠、肝、肾、肺等部位给药, 在生物医学领域表现出良好的应用前景3。2 研究方案2.1 研究目标本实验的研究目标是寻找到一种可以封装传输药物并且对牙槽骨或者其他骨组织具有诱导再生能力的运输系统结构。并且利用红外光谱检测分析和扫描式电子显微镜以及视频接触角测量仪对其进行观察检测，并在体外对这种运输系统结构的缓释功能做一个大致的描述和评价。2.2 研究内容本课题研究内容主要包括：2.2.1 鱼胶原诱导再生膜的制备和表征包括通过重力加载的办法进行“致密层”胶原诱导再生膜的制备以及作为微球囊载体的“多孔层”胶原诱导再生膜的制备。通过FTIR-650傅里叶红外光谱分析仪来对胶原诱导再生膜进行红外光谱分析，分析结果通过与鱼胶原特征吸收峰和吸收谱带进行比较来进行官能团的表征；通过扫描式电子显微镜观察诱导再生膜的微观结构。2.2.2 具有缓释功能的微球囊的制备和表征以壳聚糖溶液为水相、液体石蜡为油相形成“油包水”型乳液, 以香草醛为交联剂, 采用乳化交联法制得壳聚糖微球囊。通过扫描式电子显微镜对制备得到的微球囊进行微形貌的观察以及微球囊直径的测量。2.2.3 微球囊与胶原诱导再生膜的复合将制备好的壳聚糖微球囊加入到即将降到冰点的鱼胶原水溶液中稍加搅拌后迅速冷冻，之后在真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥，即可得到复合了壳聚糖微球囊的鱼胶原诱导再生膜。为了证明壳聚糖微球囊在鱼胶原诱导再生膜中分布的均一性，实验在制备得到的负载了壳聚糖微球囊的鱼胶原诱导再生膜上随机选取五个点取少量样品分别在FTIR-650傅里叶红外光谱分析仪上进行红外光谱分析，观察这五个点的红外光谱图中是否存在壳聚糖的特征吸收峰。此外，对复合了壳聚糖微球囊的鱼胶原诱导再生膜，本实验有一个接触角测量的部分简单的说明诱导再生膜的亲水性。2.2.4 复合微球囊后诱导再生膜的缓释功能的体外检测选用巴萨药物作为待测定缓释功能的标准药物。根据不同浓度的巴萨药物溶液在590nm处的吸光度绘制巴萨药物的吸光度标准曲线。将复合装载了巴萨药物的壳聚糖微球囊的鱼胶原诱导再生膜加入到50ml的磷酸盐缓冲溶液中并密封入离心管。之后放置于三十七摄氏度的温度条件下的PH240A恒温箱中保存，每天取出约2.5ml的上清液加入到比色皿中放入分光光度计，以磷酸盐缓冲溶液作为标准液在590nm处进行溶液吸光度的测定，通过与标准曲线进行比对定量测定溶液中巴萨药物的浓度。取出的上清液部分用等体积的磷酸盐缓冲盐水替换掉，持续此操作直到溶液内巴萨药物的浓度趋于稳定。记录并绘制巴萨药物浓度-时间图表示出复合了壳聚糖微球囊之后鱼胶原诱导再生膜的缓释功能情况。2.3 基本原理2.3.1 乳化交联法以聚合物和药物为材料制备载药微球最常用的方法是先制备成油/水、水/油、水/油/水、油/水/油型乳液后，再根据具体的用途选择适当方法使乳液固化成微球。乳化交联法就是根据药物与天然或人工高分子材料的性质制成油/水、水/油、水/油/水、油/水/油型单乳化与复乳化的乳液体系，在形成稳定的乳液后，采用连续搅拌等方法加入交联剂，由于交联剂中的活性基团（醛基）可以和高分子材料的氨基或醇基发生缩合反应，交联制得微球，同时使微球逐渐固化，经过过滤、洗涤和干燥等操作得到最终的载药微球，其粒径通常在1100m范围内。可以参加胺醛缩合反应的高分子材料有淀粉、蛋白类等，而参加醇醛缩合反应的水溶性高分子材料有聚乙烯醇、壳聚糖等。乳化交联法主要包括四个步骤：药物的加入、乳液的形成、溶剂的除去、微球的干燥及回收。而乳化交联法制备微球的关键因素是乳液体系的形成，因为乳液体系形成步骤决定着微球的粒径和粒径分布，而乳滴的外形、稳定性和固化时发生的变化则影响微球的形态。2.3.2 分光光度法分光光度法（Spectrophotometry）是一门对光谱进行量化研究的分析方法。主要涉及的电磁波谱范围是可见光、近紫外线与近红外线。这种方法不同于电磁波谱与时间分辨光谱。将含有各种波长的混合光分散为各种单色光，使每种单色光依次通过某一浓度溶液，测定溶液对每种光波的吸光度，绘出吸收光谱。由于物质的吸收光区域和强度与结构密切相关，根据特有的吸收光谱可作分子结构分析。此外，利用特定波长的单色光分别透过标准溶液与待测溶液，比较其吸光度，可作定量分析（朗博-比尔定律）。2.3.3 朗博-比尔定律又称比尔定律、比耳定律、朗伯-比尔定律、布格-朗伯-比尔定律（BouguerLambertBeer law），是光吸收的基本定律，适用于所有的电磁辐射和所有的吸光物质，包括气体、固体、液体、分子、原子和离子。比尔-朗伯定律是吸光光度法、比色分析法和光电比色法的定量基础。光被吸收的量正比于光程中产生光吸收的分子数目。公式：A = kcd （2.1）式中：A吸光度(absorbance)旧称光密度(optical density)；C样品浓度；d光程，即盛放溶液的液槽的透光厚度；k光被吸收的比例系数；当浓度采用摩尔浓度时，k为摩尔吸收系数。它与吸收物质的性质及入射光的波长有关。2.3.4 酸溶盐析法酸溶盐析法是提取纯化某些具有特定属性的蛋白质的方法。包括“酸溶”和“盐析”。蛋白质某些蛋白质（如鱼胶原）大分子难溶于水，为了提取纯化蛋白质，有时需要用适当浓度的酸或碱来促进蛋白质的溶解，此为“酸溶”。蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目，亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。蛋白质溶液中加入中性盐后，由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质，致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变，蛋白质表面的电荷大量被中和，更加导致蛋白质溶解度降低，之蛋白质分子之间聚集而沉淀。由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同，不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同，从而使之从其他蛋白中分离出来。简单的说就是将硫酸铵、硫化钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质在水溶液中的稳定性因素去除而沉淀，即“盐析”。2.4 研究方案1.2.2.32.4.1 仪器设备、材料闪式提取仪JHBE-50T真空冷冻干燥机XL-70德祥科技有限公司傅里叶变换红外光谱仪FTIR-650天津港东科技发展股份有限公司扫描式电子显微镜FEI高速离心机LDZ5-2北京显周科技有限公司冰箱BCD-256KDC青岛海尔股份有限公司恒温磁力搅拌器X85-2S上海司乐仪器有限公司电子天平BS223S北京赛多利斯仪器系统有限公司移液枪Z79175美国热电公司视频接触角测量仪JY-82C承德鼎盛试验机检测设备有限公司压片机DF-4青岛华青集团有限公司单孔电热恒温水浴锅HHSY11-Ni1北京京科华瑞集团有限公司数显直流恒速搅拌器JJ-6金坛市医疗仪器厂通风橱北京盖泽科技发展有限公司恒温干燥箱PH240A上海一恒科学仪器有限公司分光光度计Unico7200美国赛默飞世尔公司低温离心机德国贺母勒公司低温高速离心机德国艾本德公司电热恒温鼓风干燥箱上海森信实验仪器有限公司电吹风FH8251上海飞科电器股份有限公司砂纸熊猫牌北京市东升研磨工具有限公司其他仪器设备：烧杯（100ml，250ml，500ml，1000ml，2000ml，5000ml）、蓝色试剂瓶、离心管、磁力转子、温度计、超纯水净化设备、摇床、12孔板、注射器针筒、剪刀、水盆、铁架台等。2.4.2 药品司班80 （Span 80）分析纯天津市光复精细化工研究所吐温80 （Tween 80）分析纯天津市福晨化学试剂厂异丙醇分析纯北京化工厂甲酸分析纯天津市光复科技发展有限公司乙醇分析纯北京化工厂液体石蜡分析纯天津市光复精细化工研究所石油醚分析纯天津市光复科技发展有限公司香草醛分析纯北京瀛海精细化工厂壳聚糖分析纯济南海得贝海洋生物工程有限公司磷酸二氢钾分析纯北京化工厂氯化钾分析纯北京化工厂磷酸氢二钠分析纯北京化工厂氯化钠分析纯北京化工厂乙酸分析纯北京化工厂氨水分析纯北京化工厂硬脂酸镁分析纯北京化工厂其他材料与试剂药品：鱼鳞，自配磷酸盐缓冲液（PBS溶液）等。2.4.3 主要药品试剂的配制与贮存1) 磷酸盐缓冲溶液（PBS溶液）：1000ml蒸馏水中溶解0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾、2.9g磷酸氢二钠以及8.0g氯化钠药品，充分混匀后分装，高压下蒸汽灭菌二十分钟，4C环境温度下保存。2) 低浓度醋酸溶液：用于处理闪式提取机处理之后的鱼胶原粗提液，溶解其中的鱼胶原。取用高浓度醋酸溶液稀释得到，保存在4C环境温度下。3 实验步骤3.1 从鱼鳞中提取鱼胶原作为制备骨诱导再生膜的原材料1) 鱼鳞预处理：除去鱼鳞粘连的鱼皮，将鱼鳞洗净,晒干。用粉碎机切碎待处理鱼鳞；2) 加入适量蒸馏水，闪式提取2次，每次2min，目测鱼鳞已初步打碎即可；3) 胶原蛋白提取：以溶胀比1:15-30加入低浓度醋酸溶液，混合均匀，放置4h，之后以3500-5500r/min转速离心5-30 min，除去杂质，取上清液，备用；4) 除去杂蛋白：将粗提液和 NaCl溶液按重量配比混合，以3500-5500r/min转速离心5-30 min，弃去上清液，沉淀用10倍体积的0.5mol/L的乙酸溶解，以3500-5500r/min转速离心5-30 min。重复此步3次左右；5) 除酸以及除盐：将几次盐析过后得到的上清液透析三天，每半天换一次蒸馏水。透析袋孔径为3500；6) 干燥样品：将透析过后的胶原溶液用真空冷冻干燥机进行干燥，即可得胶原蛋白制品；7) 制备出具有“致密层-多孔层”双层结构的鱼胶原骨诱导再生膜材料；8) 通过重力加载的方式将冷冻干燥的鱼胶原材料压制成型为骨诱导再生膜的“致密层”；9) 在“致密层”的基础上覆盖未定型的鱼胶原凝胶物质，再次进行统一的冷冻干燥处理；3.2 壳聚糖载药微球的制备1) 称取50ml液体石蜡、1.5g Span、0.8g Tween 80以及1.5g硬脂酸镁配成溶液作为油相；2) 在40C水浴条件下恒温搅拌30min，搅拌速度为800r/min；3) 配出15g质量浓度为2.5%的壳聚糖乙酸溶液作为水相；4) 将水相加入已经在搅拌中的油相，保持原转速搅拌0.5h；5) 加入已配好的质量分数为2.5%的香草醛的乙醇溶液，搅拌3h-4h；6) 加入30g石油醚，搅拌10min；7) 3500r/min的转速离心分离固体产物；8) 用异丙醇溶液洗涤3-5次；9) 真空冷冻干燥12h；10) 将得到的壳聚糖微球均匀混合在未定型的鱼胶原凝胶物质中冷冻干燥。3.3 FTIR-650傅里叶红外光谱分析仪操作步骤1) 连接FTIR-650傅里叶红外光谱分析仪和相对应计算机的电源，打开位于FTIR-650傅里叶红外光谱分析仪背部的开关和开启计算机；2) 点击电脑屏幕打开红外光谱工作站软件；3) 取适量待测样品置于研钵中，研磨成细粉末状； 4) 加入适量溴化钾，研磨成细粉末状；5) 将粉末状样品转移至压片模具中并在DF-4压片机上进行压片，10-20MPa压制一分钟即可；6) 点击采样品按钮，按软件提示进行背景采集；7) 将压制好的样品片置于样品仓内的样品架上，点击确定进行样品数据采集；8) 保留采集得到的*.csv数据文件，用自己携带的移动存储设备将数据拷贝出；9) 退出系统，关闭计算机电源和FTIR-650傅里叶红外光谱分析仪；10) 可自行选取采用的数据分析处理软件或是画图软件，本实验采用的是origin8.5软件。3.4 扫描式电子显微镜操作步骤1) 用剪刀或者刀片剪取适当大小的导电胶粘在样品座上，将待观测的样品放置于导电胶上粘牢固（对于导电性能不好且样品块较大的样品应提前予以喷金操作）；2) 点击电脑屏幕上的“Vent”键放气进入样品交换室内部直至灯亮；3) 松开样品交换室锁扣，打开样品交换室，取下原有的样品台，将已固定好样品的样品台，放到送样杆末端的卡抓内（注意：样品高度不能超过样品台高度，并且样品台下面的螺丝不能超过样品台下部凹槽的平面）；4) 关闭样品交换室门，扣好锁扣；5) 按“pump”按钮，开始抽真空，待真空达到一定程度，图标点亮；6) 按住鼠标中部的滚轮上下拉动样品台至一个便于观察的位置；7) 观察样品室的真空“PVG”值，当真空达到9.010-5Pa时，按下屏幕上的“beam on”键开始发射电子束，同时可以打开四个观察窗口中便于观察的那个，调节电压数值使界面变得清晰；8) 操作键盘上按键调节黑白平衡“Quick View”，将放大倍率调至最低，点击“Stage Map”，对样品进行标记，按顺序对样品进行观察；9) 操作键盘上按键“+”放大观察倍数，操作键盘上按键“F7”进入调节焦距界面；按住鼠标中键左右滑动调节焦距，如果过程中觉得视野中光线进量不足，可重新调节一次电子显微镜的黑白平衡即可获得较为良好的视野亮度；10) 操作键盘上按键“F4”即可进行视野范围内的拍照，拍照后可以选取屏幕上的直径量取工具进行标注；11) 将拍得的照片保存在特定的文件夹中，用未曾使用过的光盘拷贝数据文件；12) 点击屏幕上的“beam on”按钮使其变色，取消电子注入；13) 按下vent键放气进入样品交换台直至指示灯亮起；14) 拉开样品交换室的门，取出样品台。3.5 Unico7200紫外可见分光光度计使用步骤1) 连接电源，打开位于Unico7200紫外可见分光光度计背部的仪器开关；2) 将将要测量的待测溶液和对比的标准溶液分别加入不同的比色皿，并且插入样品仓内部的槽内；3) 将旋钮旋至需要测量的波长处，将样品操控杆拉至标准样溶液比色皿处，按下分光光度计上的调零键调零；4) 将样品操纵杆拉至待测溶液比色皿处，从分光光度计的屏幕上读出吸光度数据；5) 将读出的吸光度数据代入标准曲线绘制时的回归得到的线性方程中，根据朗博比尔定律，可以得到溶液中此种物质的浓度；6) 取出样品仓中的装样比色皿，清洗留待下次使用；7) 关闭分光光度计的电源开关。3.6 JY-82C视频接触角测量仪操作步骤1) 连接电源。打开JY-82C视频接触角测量仪开关和对应的计算机的电源开关；2) 在计算机的桌面上找到JY-82C软件，打开；3) 取少量蒸馏水置于任意容器中，用视频接触角测量仪上的注射器吸取少量进入注射器内；4) 将待测样品放在视频接触角测量仪测量台上适当的位置；5) 点击JY-82C软件内的“活动图像”，即可即时