电场刺激下皮层神经细胞内DCC分子基因表达的研究VIP

单位代码 10006 学 号 10101008 分类号 密 级 秘 密 毕业设计(论文)电场刺激下皮层神经细胞内DCC分子基因表达的研究院（系）名称生物与医学工程学院专业名称生物工程学生姓名阳雨辰指导教师刘美丽2014年5月北京航空航天大学本科生毕业设计（论文）任务书、毕业设计（论文）题目：电场刺激下皮层神经细胞内DCC分子基因表达的研究 、毕业设计（论文）使用的原始资料（数据）及设计技术要求：本实验研究在文献调研的基础上，发现神经导向生长分子Netrin-1能够有效地与其受体DCC结合，以促进神经突起的导向延伸。但是，外加电场对神经导向生长的研究尚未见报道。本研究拟采用不同条件的电场刺激，检测原代培养的皮层神经元内受体DCC的表达，通过免疫荧光检测电刺激后神经突起的延伸生长情况，RT-PCR对DCC基因mRNA表达水平进行检测。设计技术要求包括大鼠皮层神经细胞的分离与原代培养、细胞电场加载实验、免疫荧光检测、RT-PCR技术。 、毕业设计（论文）工作内容： 工作内容主要包括三个方面：1、大鼠皮层神经细胞的原代培养：采用原代培养技术，对出生当天的新生SD大鼠乳鼠进行大脑皮层神经细胞的分离培养和鉴定。2、电场加载实验：采用电场刺激仪，利用铂电极对培养的细胞进行电刺激，分别检测0mv, 50mv，100mv作用2h、4h后，观察细胞的形态变化。刺激后的细胞，进行多聚甲醛固定后，采用免疫荧光技术，检测-tublin III，观察神经突起的延伸变化。3、RT-PCR检测DCC分子：对刺激后的细胞进行Trizol裂解后再RNA提取，对DCC分子基因进行RT-PCR扩增，检测其基因表达水平。 、主要参考资料：1、Rajasekharan S, Baker KA, Horn KE, Jarjour AA, Antel JP, Kennedy TE: Netrin 1 and Dcc regulate oligodendrocyte process branching and membrane extension via Fyn and RhoA. Development 2009, 136(3):415-426. 2、Kim, T. H., Lee, H. K., Seo, I. A., Bae, H. R., Suh, D. J., Wu, J., Rao, Y., Hwang, K. G. and Park, H. T. (2005) Netrin induces down-regulation of its receptor, Deleted in Colorectal Cancer, through the ubiquitin-proteasome pathway in the embryonic cortical neuron. J Neurochem, 95, 1-8. 3、Li, X., Gao, X., Liu, G., Xiong, W., Wu, J. and Rao, Y. (2008) Netrin signal transduction and the guanine nucleotide exchange factor DOCK180 in attractive signaling. Nat Neurosci, 11, 28-35. 4、Norman, L. L., Stroka, K. and Aranda-Espinoza, H. (2009) Guiding axons in the central nervous system: a tissue engineering approach. Tissue Eng Part B Rev, 15, 291-305. 5、Smith, D. H. (2009) Stretch growth of integrated axon tracts: extremes and exploitations. Prog Neurobiol, 89, 231-239. 6、Rajasekharan S, Bin JM, Antel JP, Kennedy TE: A central role for RhoA during oligodendroglial maturation in the switch from netrin-1-mediated chemorepulsion to process elaboration. J Neurochem 2010, 113(6):1589-1597. 7、Abigail N Koppes, Angela M Seggio and Deanna M Thompson. Neurite outgrowth is significantly increased by the simultaneous presentation of Schwann cells and moderate exogenous electric fields.2011, J. Neural Eng. 8, 046023 (13pp).生物与医学工程 学院（系） 生物工程 专业类 101011 班学生 阳雨辰 毕业设计（论文）时间： 2014 年 3 月 7 日至 2014 年 6月10日答辩时间： 年 月 日成 绩： 指导教师： 兼职教师或答疑教师（并指出所负责部分）： 系（教研室） 主任（签字）： 注：任务书应该附在已完成的毕业设计（论文）的首页。本人声明我声明，本论文及其研究工作是由本人在导师指导下独立完成的，在完成论文时所利用的一切资料均已在参考文献中列出。作者：阳雨辰签字：时间：2014年 5 月北京航空航天大学毕业设计(论文)第 38 页电场刺激下皮层神经细胞内DCC分子基因表达的研究学 生：阳雨辰指导老师：刘美丽摘要目的 根据建立的新生SD大鼠皮层神经元原代体外培养的方法培养皮层神经元，并对培养成熟的神经元做免疫荧光染色，以鉴定所培养的神经元。对所培养的神经元在不同电压下加载不同时间，明确不同条件电场刺激下神经导向分子受体DCC分子的基因表达水平。为研究电场与神经导向生长的分子机制奠定基础。方法 对体外培养的皮层神经元在电压为50mV、100mV条件下分别加载2h和4h，并对电场加载的神经元进行Tubulin-免疫荧光染色观察神经元在不同电场条件下的形态变化以及轴突长度的变化；以及通过RT-PCR以及Realtime PCR获取DCC分子的基因表达情况，确定DCC分子基因表达的最佳条件，为后续神经导向生长机制提供依据。结果 原代皮层神经元在体外培养情况下，7天可达最好细胞状态。电场刺激下神经元的轴突长度都有显著性地增加，DCC分子在电压为50mV条件下加载4h基因表达显著增加。结论 成功体外培养原代皮层神经元，初步确定了DCC分子基因表达最佳的电场刺激条件，具有一定实际意义和应用价值。关键词：神经细胞的原代培养、电场加载、免疫荧光染色、DCC受体、RT-PCRDCC Gene Expression in Cortical Neuron in the condition of Electrical StimulationAuthor: YANG Yu-chenTutor: LIU Mei-liAbstractObjective: Electrical stimulation can promote axonal outgrowth, but its mechanism is not clear yet. In this study, the axonal guidance growth cues Netrin-1 receptor DCC (Deleted in Colorectal Cancer) was investigated by RT-PCR assay after electrical stimulation. Methods: rat cortical neurons were primary cultured here, then cortical neurons were identified by IF (immuno-fluorescence) assay with mouse anti- Tubulin- antibody. Primary cultured cortical neurons were subjected to electrical stimulation at 50mV and 100mV for 2h and 4h in vitro, and DCC was detected by RT-PCR. Results: Axonal elongation increased significantly (n=97, p0.001) after electrical stimulation on the primary cultured cortical neurons. In addition, gene expression of DCC increased significantly (n = 5, t = 2.56, p 0.05) stimulation at 50mV for 4h. Therefore we successfully cultured primary cortical neurons in vitro, and identified the best condition of DCC gene expression, it could be a good foundation for further research in molecular mechanism of axon guidance growth.Key words: Primary Cultured cortical neuron, Electrical stimulation, IF, DCC, RT-PCR目录1绪论11.1 概述11.1.1 神经系统的功能与组成11.1.2 神经细胞培养11.1.3 神经细胞鉴定的主要方法21.2 课题背景31.2.1 神经损伤及修复31.2.2 神经导向生长51.3 研究目的81.4 论文构成及研究内容82实验材料和方法102.1 实验材料与设备102.1.1 实验药品102.1.2 实验器材102.1.3 实验动物102.2 大鼠皮层神经细胞原代培养102.2.1 手术器械的高压消毒102.2.2 DMEM高糖培养基过滤灭菌112.2.3 细胞培养流程112.3 电场加载实验122.4 免疫荧光染色122.4.1 准备细胞122.4.2 染色流程122.5 FDA（Fluorescein diacetate 乙酰荧光素）染色132.5.1 配制染色所需的试剂132.5.2 染色步骤132.6 RT-PCR检测DCC分子142.6.1 总RNA的提取142.6.2 反转录合成cDNA152.6.3 PCR反应162.6.4 DNA电泳检测162.7 Realtime PCR检测DCC分子基因表达173实验结果与讨论183.1 神经细胞原代培养183.1.1 培养初期神经细胞183.1.2 培养中期神经细胞183.1.3 培养后期神经细胞193.2 神经元染色结果193.2.1 Tubulin-免疫荧光染色203.2.2 DAPI核染以及叠加结果223.2.3 FDA染色结果243.2.4 不同电刺激电压及刺激时间条件下神经元轴突长度变化243.3 RT-PCR检测DCC分子基因表达253.3.1 所有实验组RT-PCR结果253.3.2 RT-PCR灰度值统计结果253.4 Real time PCR检测DCC分子基因表达结果284结论与展望29致谢31参考文献321 绪论1.1 概述1.1.1 神经系统的功能与组成神经系统(nervous system)在机体内起主导作用。人体是一个复杂的机体，各器官、系统的功能不是孤立的，它们之间互相联系、互相制约；同时，人是生活在一个环境多变的条件中，环境的变化随时影响着体内的各种功能。这就需要对体内各种功能的实现进行有效的调节，使机体适应内外环境的变化，神经系统就能实现这一调节功能。机体内部和外部环境的各种信息（尤其是电场的刺激），由感受器接受后，通过周围神经中枢和各级中枢进行整合，以维持机体与内部和外部环境的相对平衡。神经系统细胞包括神经元、神经胶质细胞以及神经突触。（1）神经元 神经元(neuron)是一种高度特化的细胞，它能感受刺激并且传导兴奋。神经元由胞体和突触这两个部分构成。神经元突触根据形状和机能可以分为树突(dendrite)和轴突(axon)。树突较短但分支较多，并且各类神经元树突的数目不等，形态也各不相同。每个神经元只发出一条轴突而轴突的长短是不一样的，神经元发生的电信号则沿轴突传出。 根据突起的数目，可将神经元从形态上分为假单极神经元、双极神经元和多极神经元2三大类1 。 （2）神经胶质细胞 神经胶质细胞(neuroglia)的数目是神经元1050倍3 ，胶质细胞的突起没有树突和轴突的分别，胞体比较小，胞浆中没有神经原纤维和尼氏体而且它也不具有传导神经冲动的功能。神经胶质对神经元胞体起着营养保护和支持绝缘的作用，并且参与血脑屏障的构成2 。 （3）神经突触 突触就是神经元之间互相接触的方式，因为神经元间不是细胞质的互相沟通。突触通常是一个神经元的轴突与另一个神经元的树突借其发生联系，神经的电信号是由一个神经元通过突触传递到另一个神经元的。1.1.2 神经细胞培养主要材料神经细胞的原代培养被认为比那些在体外多次传代的神经细胞株更能代表体内的神经细胞的正常发育状态13 。国内从60 年代开始已有人14,15 培养脑神经细胞。 而由于神经细胞是一种高度分化的细胞，在动物出生后很少分裂；而且神经元分化程度高，神经突起发育成熟，从成熟神经组织分离神经元，会使神经元受到更大的普遍损伤，因此对神经元进行分离培养的要求较为特殊，难度也较大。传统的神经元原代培养使用的实验材料均为胎鼠16-18 ，用新生鼠的较少19 。这是由于鼠类的神经元和神经胶质细胞在出生时都没有分化成熟，这种细胞具有比较强的适应环境的能力，更易成活。临产(21d) 的胚胎和新生动物20是最好的脑细胞培养物的选择。新生鼠和胚胎鼠是不同的，它的神经元的分化程度更高一些，神经突起发育更加成熟，神经元和神经元之间以及神经元和纤维组织之间的连接都要更加紧密，在实验操作的消化过程中更容易造成损伤21 ，由于取材于新生鼠的脑组织的神经元细胞原代培养的成功率比较低，目前国内外传统的神经元原代培养所使用的实验材料都是胚胎鼠，使用较少的新生鼠。然而，用胚胎鼠做实验材料的缺点不仅在于耗资大，还在于孕鼠的孕期比较难以控制，因此近年来多用新生鼠代替胎鼠进行神经元原代培养。1.1.3 神经细胞鉴定的主要方法（1）免疫细胞化学技术 在体外培养环境下，神经细胞的形态变化极大。目前通常采用的神经元鉴定方法为免疫染色方法。免疫细胞化学技术是利用特异性抗体显示组织或细胞化学成分（抗原）的技术。其优点在于能够对细胞的某种或者某些化学成分进行特异性的显示。免疫细胞化学方法包括固定，制片和反应三个基本步骤22 。免疫酶组织化学采用酶标记的抗体直接或者通过特异性抗体间接地与组织中的抗原结合，然后用酶的特异性底物以及显色系统来显示抗原存在的部位。最常用来标记抗体的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。HRP的底物及显色系统通常用过氧化氢-二氨基苯胺，而AP的底物及显色系统一般用磷酸萘酯-偶氮染料。该方法的突出优点是能够较好地显示细胞轮廓，特别是经过适当称染之后，阳性信号定位更明确23 。免疫酶组织化学染色标本经过封固后可以较长时间保存，便于进行回顾性研究。该方法的主要缺点是反应步骤相对繁杂，因涉及酶促反应，反应条件相对苛刻，对显色控制的技术要求较高。免疫荧光组织化学采用荧光物质标记抗体来显示抗原存在部位。最常用来标记抗体的荧光物质有异硫氰酸荧光素（FITC），四甲基异硫氰酸罗达明（TRITC），德克萨斯红(TR)24 。免疫荧光组织化学反应后，以一定波长的光进行激发，抗原存在部分发出特定波长的荧光，利用荧光显微镜进行观察和摄影。其有点是比较简便和快捷，而主要缺点是荧光容易淬灭，需及时进行观察和摄影，染色标本不能长时间保存。常用的神经细胞标志性物质列举如下：NSE，神经元型烯醇化酶。Tubulin，微管蛋白。MAP2(Microtubule-associated Protein 2)，微管相关蛋白2。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，星形胶质细胞的特异性标志蛋白。NF即神经中丝，是神经元特异的标志物，主要分布在胞浆，尤以突起的起始部为多。nestin（巢蛋白）：神经巢蛋白，是最大的中间丝蛋白，分子量为210-240KDa，nestin划分为类中间丝，是神经干细胞的一种特异性标志物，在胚胎时期的神经干细胞和未成熟的星形胶质細胞中表达，出生后在成熟的星形胶质细胞中消失，但在活动性星形胶质细胞会重新出现。成熟的CNS中不表达nestin。（2）DAPI染核技术DAPI染色原理：DAPI（4，6-联脒-2-苯基吲哚）与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA的双链紧密结合。且结合后可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光25。用荧光显微镜进行观察时，DAPI染液是用紫外光波长的光进行激发。当DAPI和双链DNA结合时，吸收波长的最高峰在358 nm处，发射波长的最高峰在461 nm处，而它光的波长范围是包括从蓝色到青绿色这一大段。DAPI不仅可以喝双链DNA结合，它也可以和RNA结合，但它与RNA结合时产生的荧光强度没有它与DNA结合时的强度高，它的光波长范围约在400 nm附近，呈现的是蓝色26 。1.2 课题背景1.2.1 神经损伤及修复1、概述神经系统在机体的正常生命活动中扮演了重要角色。机体内各器官组织间的协调以及机体对外界环境的变化作出反应都需要神经系统的参与。神经系统损伤可能会造成感觉、运动功能的丧失甚至意识和行为的改变，这可能会对伤员的生活自理能力造成影响也会对伤员家庭以及社会带来比较大的负担27，所以神经损伤的修复就更加重要了。神经损伤不仅伤害性大，它在各种自然灾害以及意外事故中也非常常见。在细胞层面，神经损伤主要表现为神经元的丧失或神经纤维受损27；在组织器官层面，神经损伤可以表现为骨骼肌功能丧失甚至萎缩28以及部分器官无法对神经调控进行反应继而丧失功能，进而造成人体生理调控紊乱而带来严重后果。神经损伤的修复在微观层面需要神经细胞和神经纤维的再生，以及新生的神经细胞向损伤部位的迁移27，并且受损处的神经细胞需要与适当的靶标建立突触联系，以此恢复其功能。但是这个过程却会因为髓磷脂的抑制作用、神经元细胞死亡以及损伤处缺少合适的基质而变得困难28-31。同时，神经修复也会受到环境因素的影响，如：神经胶质细胞和神经营养因子的参与、损伤处表面形貌以及外部的生物物理环境因素等33。于是我们需要寻找能有效促进神经损伤修复的办法。2、主要方法神经损伤修复对神经损伤病人生活自理、减轻疾病痛苦以及恢复正常生理功能都是非常重要的。传统的神经损伤修复可以归纳为两个主要的方式：一种是直接修复受损处，以自体修复或者移植的方式实现损伤的愈合。这种方式在临床多采用外科损伤修复技术，包括神经断端缝合修复和轴索修复。神经断端缝合修复即采用外科缝合的方法把断裂的神经重新缝合在一起，其中无缝缝合技术受到越来越多的重视，因为它可以有效减少瘢痕的出现27。除外科损伤修复以外，神经的自体移植以及神经组织工程也为神经损伤修复带来了新的力量；另一种是间接修复损伤，以减缓对神经再生抑制的方法实现损伤处细胞的再生以实现损伤修复。这种方式主要表现为通过基因工程的方法向细胞中导入促进神经生长的细胞因子34或是导入阻抑nogo蛋白的基因35，以此促进神经细胞的生长。干细胞为神经损伤修复注入了新鲜的血液。神经干细胞已经在临床应用，并且取得了一定的疗效。但是它仍有很多缺陷，如：干细胞来源有限，无法大量应用于临床治疗；干细胞在局部的存活率较低，应用的有效性不够；临床上对干细胞在损伤处发挥的作用检测机制不完善，无法判断干细胞是否发挥了神经元的作用等27。电场对神经的影响已经有了大量的阐述。早在1982年，Baker等36在伤口修复以及神经发育的体内实验中发现神经细胞及其支持细胞如施旺氏细胞都存在于稳定的电场梯度中，而该电场强度就在40-140mV/mm的范围内。而神经元在体外电场环境中会表现出不一样的特征：阴极趋向性37、阳极趋向性38、神经轴分支增加39、神经发生增加40或者没有反应41。由此，电场对神经损伤修复也有了大量的研究。临床上，电刺激对周围神经的功能康复有比较好的效果。不同频率的电刺激对周围神经的作用也是不一样的，低频可诱导施旺氏细胞增殖以及髓鞘的修复42；中频可提高疼痛阈值，减轻疼痛感；高频可改善损伤区的血液循环以促进修复43。另外，对脊髓损伤动物模型施加外加直流电场（200mV/mm）发现，脊髓血流量、诱发电位以及脊髓的功能都有了较大的改善44。电场对神经元的迁移也有很重要的作用。Yao等45研究发现大鼠海马体细胞内的细胞器会在电场作用下发生不对称分布，从而导致细胞的不对称分布。Jaffe和Poo46发现鸡背侧神经节外植体在稳定的dc电场中会表现出电场不同极性的迁移。但是电场对神经损伤修复的具体机制仍有待于更加深入的研究。1.2.2 神经导向生长1、概述大脑内的信息传递过程从很大程度上是由内部神经连接网络决定的。中央神经系统（CNS）中神经元的连接程度是十分惊人的。成人脑中每1012个神经元平均与1000个靶细胞相连，因此形成了一个特定的回路，这个回路模式是否正确对神经系统功能是否正确非常重要。在神经系统整体形态形成的过程中，神经元在特定的区域产生，然后通过特定的途径进行转移，直到到达其目的地。每一个神经元形成一组表现其表现型的树突以及延伸以形成特定途径到达其突触靶标的神经轴48。这个过程即为神经轴的导向生长。神经轴的导向生长需要其与基质的粘附作用以及引导信号提供的方向相关的信息。粘附受体将胞外基质的信号传导给细胞骨架，因此给生长椎的移动提供了必须的牵引力，同时引导信号在与粘附受体吸引和排斥的过程中为其提供了方向的信息49-52。然而，因为粘附分子也可以提供方向信息修改引导信号提供的信息，所以吸引和排斥并不能严格地区分出来51-55。生长椎将提供的信号整合并且做出反应，而这反应则通过细胞骨架的重排表现出来51,52,55。这些反应的本质更多体现在生长椎的功能特性上，而非体现在识别信号本身。神经轴导向生长的机制与白细胞的趋药性以及阿米巴变形虫的运动非常相似，成神经细胞以及神经轴在胚胎“环境”中通过特定细胞结构如神经轴生长椎以及迁移神经元导向区域的形成受到周围信号引导以“探究”周边环境64。周围的分子表现出吸引或者排斥的不同信号，生长椎会对这些信号进行整合并作出反应。对吸引信号，生长椎可能表现为神经生长或者发生牵引作用，对排斥信号，生长椎可能表现为生长椎的崩塌和回缩。2、主要的导向分子 许多分子参与到这种导向中，包括生长促进因子、细胞粘附因子（CAMs）以及胞外基质分子（ECMs）。除了这些分子，在基因、生化以及分子途径中也发现了四种保守家族引导信号分子：神经生长因子（netrins）、裂缝蛋白（Slits）、脑信号蛋白以及Eph配体。其中一种或者几种的受体也被发现了，包括结直肠癌缺失DCC（Unc40）与UNC-5、Robo、神经纤维网格蛋白、丛状蛋白以及Ephs65。（1）Netrin家族及其受体R.y. Cajal62发现作为基础神经轴导向机制的化学诱导分子：Netrin，最初它被描述为“导向的分子”。有研究表明，Netrins无论在胚胎CNS发育过程中还是CNS损伤修复中都是广泛存在的神经诱向因子63。大多数Netrin家族成员是可以控制神经元和生长椎迁移的分泌蛋白64。这些蛋白是双功能信号分子，其中一些是神经元的化学诱导因子，一些是神经元的化学抑制因子。Netrins通过与两个蛋白家族DCC以及UNC-5中的特定蛋白相互作用以发挥其功能。DCC/UNC-40既可以调节吸引反应，也可以调节拮抗反应，然而UNC-5仅发现可以调节拮抗反应65,66。哺乳动物研究表明DCC自身可以调节吸引作用，而DCC和UNC-5一同可以调节拮抗作用67。对蠕虫的神经研究表明DCC和UNC-5单独作用也可以调节拮抗作用68。对果蝇的研究表明UNC-5单独作用可调节短程拮抗作用，然而UNC-5和DCC一起可以调节长距离的拮抗作用69。Netrin-1通过DCC激活Cdc42和Rac1，并且通过Cdc42形成丝状伪足，在HEK293细胞和神经节胶质细胞系NG108-15中通过Rac1促进细胞迁移70。而抑制DCC信号能有效地阻断netrin对细胞的诱导迁移作用63。由此可知，检验神经细胞中DCC的分子基因表达可以从一定程度反映出神经细胞的迁移情况。（2）Semaphorins家族Semaphorins导向蛋白家族是一类或为分泌型或为跨膜型的糖蛋白,它们的N 端都含有 532个氨基酸残基组成的- sema区保守序列。该家族成员中 Semaphorin-1和 collapsin-1最早被发现。 Sema I是一种跨膜蛋白，它在蚱蜢的胚胎发育中起到了引导周边神经轴突生长的作用56。鼠和人的Sema III是研究较多的分泌型信号素，它们在脊髓腹侧（除底伴外）的细胞和大脑中都有高水平的表达 。 Semaphorins导向蛋白家族最早是发现它的功能与轴突有关，该蛋白家族可以影响轴突的拉伸与收缩、分枝、导向生长以及突触形成的过程。轴突发育的不同层面上会有不同的 Semaphorin蛋白发挥作用，并且该蛋白的作用常常是高度特异的负调节。除了神经系统发育方面该蛋白家族会发挥作用外，研究表明SemaIII还可以在几种不同组织的发育中发挥重要作用，并且该蛋白在发育过程中还可作为心脏发育的的生长调节因子57,58。（3）Ephrins家族Slit分子是发现的第一种对神经生长以及神经元迁移均有导向作用的分子59,60。Slits是发育期脊髓中线胶质细胞以及中隔组织分泌的一组相对分子量为170-190KD的分泌型蛋白质59。Slit分子对轴突生长起到了排斥性的导向生长作用。神经中线细胞所分泌的作为排斥信号的导向生长分子Slits蛋白会和表达在这些轴突表面的受体相互作用，这种相互作用可以决定这些轴突是否穿过中线，从而阻止已经穿过中线的轴突再次返回中线而发生中线的来回穿越现象 61。Slit分子也可促进其背根神经节轴突的延伸和分支的过程，同时它还可以抑制化学趋向因子驱使的白细胞的运动。3、电场与导向生长的关系 研究电场对神经细胞的影响可以给神经损伤的修复提供理论和方法上的支持。从现在的研究上看，在神经修复的过程中，加载电场刺激可以促进人工移植的神经突起导向延伸。神经损伤后，轴突会断裂，如果电场刺激能促进轴突的延伸和正确导向连接，那么对损伤后的神经再生将具有重大意义。但是电场刺激对神经突起的导向生长机制还不明确，因此研究电场刺激对神经细胞导向生长的影响十分重要。神经轴的导向生长与其生长椎密切相关，生长椎的延伸方向决定了神经轴延伸的方向。许多化学分子会参与到神经细胞的迁移过程中，神经导向分子（Netrin）是其中非常重要的一种化学分子。这种分子能吸引或排斥神经轴生长椎，从而引导生长椎的生长方向。然而Netrin对生长椎的引导作用的实现需要其受体的存在，结肠癌缺失（DCC）是Netrin的一个非常重要的受体，它能与Netrin相互作用，参与神经轴的形成，引导神经轴的导向生长。因此对电场刺激的大脑皮层细胞进行DCC分子表达检测就能从一定程度上检测出大脑皮层细胞在电场的作用下其神经轴的导向生长情况，为神经损伤修复提供理论基础。神经损伤修复需要神经元的再生、神经元朝向损伤处的迁移以及损伤区域神经轴与靶标之间建立联系。电场会对神经的导向生长（迁移）产生影响，而神经元的迁移还会受到其他多种因素的影响，其中体内的化学分子可以引导神经向不同方向迁移。如果电场对神经迁移的影响与体内化学分子对神经迁移的影响一致则可以从一定程度说明电场的刺激可能导致这些化学分子刺激神经发生神经导向生长。1.3 研究目的神经元和神经轴是神经系统的重要组成部分，但是神经元以及神经轴的损伤对神经系统正常功能的实现造成了很大的困难，所以怎样实现损伤的神经元以及神经轴的恢复是一项非常重要的课题，神经功能的恢复在很大程度上依赖于神经轴的生长以及突触的重新建立，有研究表明神经轴的生长以及突触的重新建立依赖于神经导向生长过程。在众多实现损伤神经恢复功能的方法中，电刺激是近年来提出的比较可行的方法，但是电刺激对神经轴生长的机制并不清楚，神经轴生长以及突触的建立是否与神经导向生长相关也没有相关文献支持。本研究通过对皮层细胞进行电场加载并检测神经突起的延伸变化以及神经导向受体DCC的分子基因表达，以此分析电场刺激对神经轴突迁移的影响，为神经损伤修复在理论和方法上提供实验依据。1.4 论文构成及研究内容本文分为 4个章节，除了第一章的绪论外，第二章介绍了实验材料和实验方法，对原代皮层神经细胞的体外培养提出了切实可行的操作流程，对于神经细胞加载电场对其进行电刺激观察细胞形态以及基因表达情况详细叙述了实验的设计过程、实验步骤以及实验中发现的问题。第三章是实验结果分析，在这一章中，给出了成功培养原代神经细胞的实验图、列出了部分成功的实验数据，并且讲述了实验数据的处理方法，针对每项实验设计处理均分析了结果。最后一章是结论和展望，对神经细胞体外原代培养的方法给予了肯定，综合第二章和第三章对实验结果进行了总结并针对本实验的结果提出了今后实验发展的方向。本课题研究内容主要包括： 1、大鼠皮层神经细胞的原代培养：采用原代培养技术，对出生当天的新生SD大鼠乳鼠进行大脑皮层神经细胞的分离培养和鉴定。2、电场加载实验：采用电场刺激仪，利用铂电极对培养的细胞进行电刺激，分别检测0mv, 50mv，100mv作用2h、4h后，观察细胞的形态变化。刺激后的细胞，进行多聚甲醛固定后，采用免疫荧光技术，检测-tublin III，观察神经突起的延伸变化。3、RT-PCR检测DCC分子：对刺激后的细胞进行Trizol裂解后再RNA提取，对DCC分子基因进行RT-PCR扩增，检测其基因表达水平。2 实验材料和方法2.1 实验材料与设备2.1.1 实验药品DMEM高糖培养基（DMEM，碳酸氢钠，HEPES，硫酸链霉素，青霉素），0.25%胰酶-EDTA消化液，胎牛血清，4%多聚赖氨酸包被液，4%多聚甲醛固定液，PBS洗液，阿糖胞苷溶液，一抗（兔抗tubulin-单克隆抗体），二抗（驴抗兔Cy2），DAPI 染液。双蒸水， 75%乙醇溶液，快速制冷剂。2.1.2 实验器材二氧化碳培养箱（MCO-15AC，SANYO）、超净工作台（JJ-CJ-ZP洁净工作台，吴江市净化设备总厂）、台式离心机（TDL-40B，飞鸽牌）、荧光显微镜（Olympus MT-2;Nikon）、Rocking shaker （TS-92，QILINBEIER）、恒温磁力搅拌器（81-2型，上海司乐仪器厂）、电子分析天平（AL104，Mettler Toledo）、照相体视显微镜（XTL-型，北京电子光学设备厂）、microplate reader（Model 680，BIO-RAD）、酸度计（PH510，Cyberscan）、立式自动电热压力蒸气灭菌器（LDZX-40BI，上海申安医疗器械厂）、冰箱（BCD-278A/C，Haier）、烘箱（天津市中环实验电炉公司）、培养板（24孔，96孔）、培养皿（35 mm）、烧杯（1000 ml）、移液器、枪头、酒精灯、眼科剪、镊子、手术器械、离心管、量筒、洗瓶、废液缸、载玻片、盖玻片。2.1.3 实验动物SD大鼠乳鼠（出生12h以内），由北医动物中心提供2.2 大鼠皮层神经细胞原代培养采用原代培养技术，对出生当天的新生SD大鼠乳鼠进行大脑皮层神经细胞的分离培养和鉴定。主要流程如下：2.2.1 手术器械的高压消毒将分离取脑过程中所需手术器械（镊子，手术剪，眼科剪，勺子，），10 cm玻璃培养皿，细胞过滤器，纱布，15 ml离心管，50 ml离心管，各种型号枪头用双蒸水洗净后，用报纸包严，置于高压蒸汽灭菌锅中120摄氏度，20min高压灭菌消毒，培养皿需用酒精浸泡并且同时进行紫外光照射至少三个小时以彻底消毒。2.2.2 DMEM高糖培养基过滤灭菌用电子分析天平称取碳酸氢钠2g，HEPES 2g，硫酸链霉素粉末0.1g，青霉素粉末0.1g，取Gibco公司高糖DMEM培养基一袋加双蒸水至1L后用恒温磁力搅拌器搅拌至固体物质完全溶解，调节PH至7.4。 于超净间内用0.2 m过滤器过滤已配置好的培养基。2.2.3 细胞培养流程（1）4%多聚赖氨酸包被培养板/培养皿过夜（3h以上）（2）吸尽培养板内多聚赖氨酸，等待晾干后接种细胞（3）取两个小培养皿，置于制冷剂上，各加入无血清的DMEM培养基2-3 ml（4）用75%酒精消毒乳鼠后，于超净台内取其脑置于其中一个小培养皿中（5）取大鼠乳鼠脑组织前额叶并置于另一小培养皿中（6）用镊子轻轻剥离已取好的脑组织外的脑膜，吸去原有培养基后剪碎脑组织，为消化做准备（7）加入3 ml含有1：1的0.02%EDTA：0.25%胰酶的消化液于已剪碎的脑组织中，用封口条密闭小培养皿并置于37恒温箱中20-25 min，并且每五分钟晃动培养皿促进消化过程的进行。（8）取出小培养皿，于超净台内开盖，加入3ml已含20%血清的DMEM培养基终止消化，即刻将其移入15 ml离心管内，继续加入培养基并吹打终止消化（注意防止气泡的产生且动作尽量轻柔，防止细胞损伤严重）（9）用0.2 nm的滤膜过滤所得细胞悬浮液后以1500 rpm离心5 min（10）吸出离心管上层培养基后加入1ml新培养基并吹打使沉淀的细胞团分散，继续加入培养基稀释细胞至接种密度约108（11）将细胞接种入已经铺被有多聚赖氨酸的培养板，并用蒸馏水加满四周未接种细胞的空孔（主要用于减缓培养基在培养箱中的蒸发）（12）将接种好细胞的培养板置于5% CO2，37恒温箱中培养，约2小时后在培养板中加入含20%血清的DMEM（13）第三天加入阿糖胞苷（终浓度为10 M）（14）根据培养基的情况，不定期换液（含10%血清的DMEM）。2.3 电场加载实验采用电场刺激仪，利用铂电极对培养的细胞进行电刺激，分别以电压0mv, 50mv，100mv作用2h、4h后观察细胞的形态变化。（1）原代培养的神经细胞在培养第七天即上装置进行电刺激实验（2）将电刺激实验中所需要用到的镊子、铂电极放入铝盒中，高压灭菌12120分钟（3）准备灭菌的铝盒（镊子、电极）、胶布、剪刀，超净台紫外光照射30分钟（4）将铂电极如图放置在细胞培养槽中，连上电极对其进行电刺激实验2.4 免疫荧光染色对刺激后的细胞进行多聚甲醛固定后，采用免疫荧光技术，检测tublin-III，观察神经突起的延伸变化。2.4.1 准备细胞按皮层神经元的培养流程，将2ml的神经细胞悬浮液接种于内置4片小玻片的35 mm平皿上（玻片及平皿在接种神经元之前均需用4%多聚赖氨酸包被过夜），置于37恒温箱中培养。在神经元培养的第三天，向小平皿中直接加入阿糖胞苷溶液20 l（保证其终浓度为10 M），继续置于37摄氏度恒温箱中培养。第七天做免疫荧光染色。2.4.2 染色流程（1）在培养的第七天，取出小平皿的内置小玻片，移入24孔板内（每孔一个小玻片），长有神经元的一面朝上（2）每孔加入300 lPBS溶液，轻轻振荡后吸去所加入的PBS溶液，重复三次，洗去小玻片上原有培养基（3）每孔加入4%多聚甲醛300 l，固定细胞15 min（4）洗去甲醛溶液，同步骤2，PBS洗三次，洗去残留的甲醛溶液（5）加入200 l 10%血清（需与二抗同源，本实验中为驴血清）封闭非特异性位点（6）吸去血清溶液，PBS漂洗3次后，每孔加入200 l一抗（兔抗tubulin-单克隆抗体）（用加有3%Tritons的PBS溶液稀释一抗，本实验中所用的稀释比例为1：1000）后，室温静置2h或置于4冰箱过夜（7）吸去一抗溶液，并用PBS洗三次（每次均需将24孔培养板置于摇床上振荡3-5min）（8）每孔加入200 l二抗（驴抗兔cy2）溶液（直接用PBS稀释即可，本实验所用稀释比例为1：500），避光保存1-2 h（9）吸去二抗溶液，并用PBS洗三次（每次均需将24孔培养板置于摇床上振荡3-5min）（10）往各小玻片上直接滴加10 l的DAPI溶液染核几分钟（11）取一载玻片，于其上滴一滴加有甘油的PBS溶液（甘油与PBS一比一混合），将24孔板内小玻片取出，长有细胞的一面朝下扣在混合溶液上（12）将已制好的标本置于荧光镜下观察2.5 FDA（Fluorescein diacetate 乙酰荧光素）染色2.5.1 配制染色所需的试剂（1）如表2.1配制FDA溶液（5mg/ml）表2.1 FDA溶液配制试剂名称加样量FDA0.025g丙酮5ml溶解了的FDA溶液置于-20保存（2）如表2.2配制HBSS（1L）溶液表2.2 HBSS溶液配制试剂名称加样量NaCl8gKCl0.4gGlucose1gKH2PO40.06gNa2HPO412H2O0.1285g配制好HBSS溶液后需进行除菌过滤操作，用滤器对配制好的溶液进行过滤2.5.2 染色步骤（1）20ul的5mg/ml FDA加入10ml HBSS溶液稀释（2）将配制好的溶液滴入细胞样品中（3）3-5min后将样品在荧光显微镜下观察2.6 RT-PCR检测DCC分子对刺激后的细胞进行Trizol裂解后再RNA提取，对DCC分子基因进行RT-PCR扩增，检测其基因表达水平。RT-PCR是将RNA的逆转录（RT）和cDNA的聚合酶的链式扩增（PCR）反应相结合的技术。这个过程首先要经过逆转录酶的作用将RNA逆转录合成 cDNA，以获取cDNA片段，再以cDNA为模板以此复制合成目的片段。RT-PCR技术的用途非常广泛，它可以用于直接克隆特定基因的cDNA片段、也可以用于检测细胞中RNA的含量和细胞中基因表达的水平。作为模板的RNA可以是细胞中的总RNA或者是mRNA，甚至可以是体外转录的RNA。无论使用的RNA是哪种类型，关键是要确保使用的RNA中没有RNA酶和基因组 DNA的污染，所以需要在过程中除去RNA酶和DNA。本实验采用皮层神经细胞的总RNA作为模板进行RT-PCR实验。2.6.1 总RNA的提取（1）用500ul Trizol处理细胞，充分裂解，将裂解液移至EP管中；（2）加入100uL氯仿（三氯甲烷），剧烈震荡15s，室温放置5min；（3）4，12000rpm，离心15min，取上层水相，置于另一个1.5ml EP管中；（4）加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置10min；（5）4，12000rp