《蛋白质多肽》PPT课件.ppt

多肽和蛋白质,第 一 章,从基因到蛋白质,本章内容,蛋白质基础知识 多肽的化学生物学 蛋白质化学合成 蛋白质修饰和蛋白质药物,一、什么是蛋白质?,蛋白质(protein)是由许多氨基酸(amino acids)通过肽键(peptide bond)相连形成的高分子含氮化合物。,二、蛋白质的生物学重要性,1. 蛋白质是生物 体重要组成成分 分布广：所有器官、组织都含有蛋白质；细胞的各个部分都含有蛋白质。 含量高：蛋白质是细胞内最丰富的有机分子，占人体干重的45，某些组织含量更高，例如脾、肺及横纹肌等高达80。,1）作为生物催化剂（酶） 2）代谢调节作用 3）免疫保护作用 4）物质的转运和存储 5）运动与支持作用 6）参与细胞间信息传递,2. 蛋白质具有重要的生物学功能,多肽和蛋白质基础知识,第 一 节, 组成蛋白质的元素,主要有C、H、O、N和S。 有些蛋白质含有少量磷或金属元素铁、铜、锌、锰、钴、钼，个别蛋白质还含有碘 。,蛋 白 质 的 分 子 组 成,1 氨基酸 组成蛋白质的基本单位,存在自然界中的氨基酸有300余种，但组成人体蛋白质的氨基酸仅有20种，且均属 L-氨基酸（甘氨酸除外）。,非极性疏水性氨基酸 极性中性氨基酸 酸性氨基酸 碱性氨基酸,（一）氨基酸的分类,* 20种氨基酸的英文名称、缩写符号及分类如下:,甘氨酸 glycine Gly G 5.97,丙氨酸 alanine Ala A 6.00,缬氨酸 valine Val V 5.96,亮氨酸 leucine Leu L 5.98,异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02,苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48,脯氨酸 proline Pro P 6.30,非极性疏水性氨基酸,色氨酸 tryptophan Try W 5.89,丝氨酸 serine Ser S 5.68,酪氨酸 tyrosine Try Y 5.66,半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07,蛋氨酸 methionine Met M 5.74,天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41,谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65,苏氨酸 threonine Thr T 5.60,2. 极性中性氨基酸,天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97,谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22,赖氨酸 lysine Lys K 9.74,精氨酸 arginine Arg R 10.76,组氨酸 histidine His H 7.59,3. 酸性氨基酸,4. 碱性氨基酸,几种特殊氨基酸,脯氨酸 （亚氨基酸）, 半胱氨酸,胱氨酸,二硫键与蛋白质折叠,（二）氨基酸的理化性质,1. 两性解离及等电点,等电点(isoelectric point, pI) 在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势及程度相等，成为兼性离子，呈电中性。此时溶液的pH值称为该氨基酸的等电点。,pH=pI,pHpI,pHpI,氨基酸的兼性离子,阳离子,阴离子,2. 紫外吸收,色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。,大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。1mg/ml,芳香族氨基酸的紫外吸收,肽键(peptide bond)是由一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基脱水缩合而形成的化学键。,2 肽(peptide),+,甘氨酰甘氨酸,肽键,* 肽是由氨基酸通过肽键缩合而形成的化合物。,* 两分子氨基酸缩合形成二肽，三分子氨基酸缩合则形成三肽,* 肽链中的氨基酸分子因为脱水缩合而基团不全，被称为氨基酸残基(residue)。,* 由15个以内氨基酸相连而成的肽称为寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相连形成的肽称多肽(polypeptide)。,N 末端：多肽链中有自由氨基的一端 C 末端：多肽链中有自由羧基的一端,多肽链有两端,* 多肽链(polypeptide chain)是指许多氨基酸之间以肽键连接而成的一种结构。,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,豌豆 defensin 1 三维结构,N,C,常用的蛋白质信息网站,Expert Protein Analysis System http:/www.expasy.ch/ Protein Data Bank / ,体内许多激素属寡肽或多肽,神经肽(neuropeptide),（二） 几种生物活性肽,3 蛋白质和多肽的分类,* 根据蛋白质组成成分,* 根据蛋白质形状,肽的分类,按来源分： 核糖体多肽：由mRNA翻译合成，包括激素和信号分子。 非核糖体多肽：非核糖体多肽酶催化合成，如谷胱甘肽。 合成多肽,按肽链骨架来源分,线性肽 环形肽,蛋白质的分子结构包括 一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure),4 蛋 白 质 的 分 子 结 构,定义 蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。,3.1 蛋白质的一级结构,主要的化学键 肽键，有些蛋白质还包括二硫键。,一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。,3.2 蛋白质的二级结构,主要的化学键： 氢键,蛋白质二级结构的主要形式,-螺旋 ( -helix ) -折叠 ( -pleated sheet ) -转角 ( -turn ) 无规卷曲 ( random coil ),（二） -螺旋,目 录,（三）-折叠,模体(motif),在许多蛋白质分子中，可发现二个或三个具有二级结构的肽段，在空间上相互接近，形成一个特殊的空间构象。,钙结合蛋白中结合钙离子的模体,-,Beta Helices,无规卷曲,3.3 蛋白质的三级结构,整条肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置,即肽链中所有原子在三维空间的排布位置。,（一） 定义,肌红蛋白 (Mb),纤连蛋白分子的结构域,（二）结构域,大分子蛋白质的三级结构常可分割成一个或数个球状或纤维状的区域，折叠得较为紧密，各行使其功能，称为结构域(domain) 。,亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。,3.4 蛋白质的四级结构,蛋白质分子中各亚基的空间排布及亚基接触部位的布局和相互作用，称为蛋白质的四级结构。,有些蛋白质分子含有二条或多条多肽链，每一条多肽链都有完整的三级结构，称为蛋白质的亚基 (subunit)。,一级 二级 三级 四级,卷曲螺旋(coiled coil),（一）一级结构是空间构象的基础,3.5 蛋白质一级结构与功能的关系,天然状态，有催化活性,尿素、 -巯基乙醇,去除尿素、 -巯基乙醇,非折叠状态，无活性,（二）一级结构与功能的关系,例：镰刀形红细胞贫血,毛细血管堵塞,这种由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病”。,（一）肌红蛋白与血红蛋白的结构,3.6 蛋白质空间结构与功能的关系,Hb与Mb一样能可逆地与O2结合， Hb与O2结合后称为氧合Hb。氧合Hb占总Hb的百分数（称百分饱和度）随O2浓度变化而改变。,（二）血红蛋白的构象变化与结合氧,（三）蛋白质构象改变与疾病,蛋白质构象疾病：若蛋白质的折叠发生错误，尽管其一级结构不变，但蛋白质的构象发生改变，仍可影响其功能，严重时可导致疾病发生。,有些蛋白质错误折叠后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉样纤维沉淀，产生毒性而致病，表现为蛋白质淀粉样纤维沉淀的病理改变。,这类疾病包括：老年痴呆症、疯牛病等。,蛋白质构象改变导致疾病的机理：,疯牛病中的蛋白质构象改变 疯牛病是由朊病毒蛋白(prion protein, PrP)引起的一组人和动物神经退行性病变。 正常的PrP富含-螺旋，称为PrPc。 PrPc在某种未知蛋白质的作用下可转变成全为-折叠的PrPsc，从而致病。,4 蛋白质的分离和纯化,（一）透析及超滤法,* 透析(dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,* 超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,（二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀,*使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,*盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,* 免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。,（三）电泳,蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。 根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,几种重要的蛋白质电泳 *SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。,双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术,pI,（四）层析,层析(chromatography)分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。,蛋白质分离常用的层析方法 * 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 * 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。,（五）超速离心,* 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。,5 多肽链中氨基酸序列分析,分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成,测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基,把肽链水解成片段，分别进行分析,测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法,一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。,Edman降解,异硫氰酸苯酯,6 蛋白质空间结构测定,二级结构测定 通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定溶液状态下的蛋白质二级结构含量。 -螺旋的CD峰有222 nm处的负峰、208nm处的负峰和198 nm处的正峰三个成分；而-折叠的CD谱不很固定。,三级结构测定 X射线衍射法(X-ray diffraction) 核磁共振技术(NMR),多肽的化学生物学,第 二 节,研究集中领域,多肽的化学生物学 蛋白质化学合成 蛋白质修饰和蛋白质药物,2.1 多肽的化学合成,1. 肽键形成原理和保护基 原理：多肽的合成就是形成肽键的过程，即一个氨基 酸（AA）氨基亲核进攻另一个氨基酸被活化的 羧基部分，形成肽键。 氨基酸的活性基团必须进行保护。,肽键形成步骤,制备部分保护的氨基酸，形成只有单一活性位点的氨基酸衍生物； 将氨基保护的氨基酸羧基部分活化，形成活性中间体，再与自由氨基反应形成酰胺键； 脱除氨基酸的保护基。,R1,PG,OH,O,H2N,选择性保护,R1,OH,O,NH,活化,PG,R1,NH,O,X,R2,OH,O,H2N,PG,NH,R1,O,HN,R2,OH,O,选择性脱除PG,保护基（Protection Groups）,临时性保护基：在下一个肽键形成前脱除，一般用于氨基或羧基的暂时性的保护，脱除不影响半永久性保护基。 半永久性保护基：一般用于侧链的保护，在目标序列合成后去除。 种类：叔丁氧羰基 Boc 9-芴甲氧羰基 Fmoc,2. 化学合成多肽的发展历程,早期：液相合成 1901，德国化学家Fischer合成了Gly-Gly 20世纪中期，合成活性肽，如催产素、胰岛素。 1963年，Merrifield提出了固相合成（SPPS），1984年诺贝尔奖。在1966年发明了第一台自动的固相肽合成仪。,3. 液相多肽合成,优点：成本低，目前一些的商业肽制备中有应用。 缺点： 肽片段在有机溶剂中溶解度小； 为提高产率，每步缩合过程中氨基酸片段过量，分离纯化困难。 合成周期长； 只适用小短肽合成。,步骤： 多肽的C端氨基酸通过linker键连到树脂上； 脱除氨基上的临时保护基； 与下一个氨基酸缩合； 反复进行脱保护和缩合两个步骤； 脱除半永久性保护基；,4. 固相多肽合成,NH,O,R,OH,Y,NH,O,R,O,Y,去保护,H2N,O,R,O,NH,O,R2,OH,Y,R2,O,NH,树脂,HN,Y,O,R,O,去保护,反复进行,固相多肽合成过程,根据保护策略不同分为Boc和Fmoc方法,Boc叔丁氧羰基 30%-50%三氟乙酸 强酸 很少应用,Fmoc9-芴甲氧羰基 20%哌啶 弱酸 方便,类型 脱除保护基条件 裂解条件 自动化合成,环合方式： 主链头-尾环合，侧链-侧链环合 侧链-头环合，尾-侧链环合 固相液相方法均可，但反应较慢。,5. 环肽合成,多肽很少可被作为药物利用 易水解，稳定性低，亲水性强难以跨越细胞膜,2.2 肽模拟物,肽模拟物：根据与结合受体的多肽而设计，将多 肽分子的结构信息转化成非肽结构。,分类,以酰胺类似物或二级结构类似物代替多肽的模拟物。 e.g. NH 用氧原子（ O ），硫原子（ S ），取代或是对其进行烷基化修饰。 2. 功能模拟物：作用于多肽受体的非肽类小分子，是天然多肽的结构类似物。 3. 非肽类化合物：有新型的肽母核，但包含多肽发挥作用所必须的关键功能基团。,类肽,定义：以N-取代甘氨酸为构建的单元化合物。 优点：比肽的构象柔性高，不会被蛋白酶水解，具有更高的代谢稳定性，提高生物利用度及生物活性 。,R3,O,HN,O,R2,R1,HN,O,肽,类肽,NH,O,N,R1,N,R2,O,N,R3,（1） 靶蛋白的功能位点（3-10个氨基酸） 结合小分子或蛋白质后发挥调节活性作用的区域。,2.4 多肽的应用和肽类药物,多肽,疾病诊断和治疗,生命调节过程,用途： 多肽可代替靶蛋白结合配体，研究功能位点的性质，发现新配体，用于结构研究和药物筛选。,（2） 确认靶标,寻找药理学作用的最佳位点,+,多肽,靶蛋白,特异结合,优点：比药物更容易在细胞内表达，可用于预测药物作 用位点，确认靶标。,（3）高通量筛选的替代配基,合成可与靶蛋白特定功能位点序列相同的多肽，作为检测平台，然后测定小分子置换多肽配体或阻止配体结合能力。,药物：生物利用率低，无特异性，造成周身的毒副作用。,VS,肽类药物：特异性。,2.2 蛋白质化学合成,生物表达方法的局限： 只含20中天然氨基酸，非天然氨基酸难以引入； 翻译后修饰困难，不易精确控制； 大于30 kDa的蛋白质表达不容易； 细胞中表达有毒蛋白或膜蛋白困难。,2.2.1 蛋白质的化学全合成,1. 发展历程 固相多肽合成实践中指能合成50-60个氨基酸的肽链。,连接反应,Target Protein,多肽的侧链官能团需要保护。 局限 C端氨基酸在活化的过程中容易消旋，最后脱保护步骤可能严重影响产率。,2. 自然化学连接 (Native chemical ligation, NCL),化学选择性反应-酯交换,自发重排：SN酰基转移,pH 6.5- 8.0 温度25-40,反应机理 外加硫醇与多肽硫酯发生酯交换； 新形成的硫酯与N端Cys侧链上的巯基发生酯交换，形成硫酯中间体； S-N的酰基转移，生成以Cys为连接点的多肽。,N、C端有特定的化学结构，需要一个C端为硫酯的多肽片段和一个N端为Cys的多肽片段。 不需保护基； 水溶液中进行； 高效，生成天然的酰胺键。,特 点,多肽硫酯是制备的关键，限制是Cys,Boc法制备硫酯,目前最有效方法； 但产率低，反应条件剧烈，危险。,3. NCL的应用和实例,HIV1蛋白酶的合成 抗HIV疗法的一个靶向目标，由2条含99的氨基酸的多肽组成的聚体。 HIV1蛋白酶发生变构或失活 无活性的病毒颗粒 HIV1蛋白酶是病毒复制必需酶,HIV1蛋白酶的合成过程,A1-A40,B42-B99,A42-A99,B1-b40,A1-A40,A42-A99,B1-b40,B42-B99,A1-A40,A42-A99,B1-b40,B42-B99,GlnA41,Gln-(Gly)4,GlnB41,CysA41,CysB41,GlnA41,GlnB41,+,+,Cys,-(Gly)4,Cys,-(Gly)4,生物学的方法 内含肽 表达蛋白连接（express protein ligation,EPL） 优点： 一、可在蛋白质中引入数量不限的非天然氨基酸； 二、能实现大范围的蛋白修饰。,2.2.2 蛋白质的化学半合成,1. 发展历程,1）蛋白质半合成的提出 天然蛋白 水解切断 片段 合成蛋白质 2）化学性连接方法：Kent ，解决了保护的问题，需要引入N端Cys 或C端硫酯，重组蛋白制备问题。 3）蛋白质剪接技术的发明和应用,内含肽（Intein）是一段随功能蛋白一起表达，并在表达后可进行自剪接的多肽。它兼有蛋白酶和蛋白连接酶的特性，与内含子（RNA水平自剪切）的作用方式类似。,什么是内含肽？,1994年perler报道了第一个存在于啤酒酵母VAM1基因的内含肽后，已鉴定出400多种,蛋白质剪接过程,第1步：剪接是由N末端的半胱氨酸的N S或是N-O的酰基迁移，将N端外显肽1连接到内含肽N端Cys的巯基上形成硫酯； 第2步：发生转酯化反应：外显肽2的N端半胱氨酸残基巯基攻击硫酯，形成一个分支状的酯或硫酯中间物； 第3步：是肽键的断裂伴随着内含肽C末端琥珀酰胺的形成，使内含肽释放出来。接着放生S N或S-O酰基转移，形成一个稳定的酰胺键，从而形成一个成熟的外显肽。,蛋白质剪接机理,1: 酰基转移,2: 转酯化反应,3: 琥珀酰胺中间体,4: 酰基转移,Chong et al. (1996) J. Biol Chem. 271:22159,亚酰胺,内含肽的应用,生产环肽和蛋白 蛋白质纯化 位点特异性蛋白修饰 分子间蛋白质互作 蛋白连接（IPL）,2. 表达蛋白连接（EPL),始于1998年，利用蛋白质剪接技术。 硫酯是NCL和EPL的活性关键基团,蛋白硫酯通过重组表达获得。 利用蛋白剪接制备硫酯。,HS,HN,蛋白剪接制备硫酯,NH,O,多肽,内含肽,CBD,O,S,O,多肽,H2N,内含肽,HN,CBD,O,RSH,SR,O,多肽,硫酯,HS,H2N,内含肽,HN,CBD,O,HN,HS,HN,表达蛋白连接示意图,NH,O,多肽1,内含肽,CBD,O,S,O,多肽1,H2N,内含肽,HN,CBD,O,RSH,O,多肽1,HS,多肽2,NCL,3. EPL的应用实例,蛋白质翻译后修饰 引入非天然氨基酸,（1） 蛋白质翻译后修饰,糖基化、磷酸化、酯化,生物学方法：不受基因调控，修饰困难。,化学方法：可用于位点修饰，但化学全合成困难。,例子：Muir利用EPL用于泛素化组蛋白H2B的合成,H2B(118-125),泛素(1-75),O,SR,H2B(118-125),泛素(1-75),H2B(1-116),H2B(1-116),H2B(118-125),泛素(1-75),脱硫,(2) 引入非天然氨基酸,蛋白质上嵌入非天然氨基酸 蛋白质结构功能 利用EPL可以在蛋白质中引入荧光探针分子、同位素分子等基团。,(3) 研究蛋白质相互作用,绿色荧光蛋白GFP,（4） 蛋白质固定化用于生物芯片研究,蛋白连接,几种蛋白纯化方法,（5） 内含肽介导的蛋白质纯化,C 端融合 N 端融合,优点,使用亲和层析的方法得到无亲和标签的蛋白， 避免使用昂贵的蛋白酶切除亲和标签； 可得到无甲硫氨酸和载体氨基酸残基的蛋白质。,（6） 蛋白质环化,TRENDS in Biochemical Sciences Vol.27 No.3 2002,70年代Gran首先在一种非洲植物发现一种由29个氨基酸的环肽Kalata B1后，人们相继从微生物、动植物中发现了环形的肽和蛋白。,环化的生物学意义,增强抵抗氨肽酶、羧肽酶的作用; 增加蛋白的稳定性 ，也可能提高蛋白的生物效价; 提高蛋白的折叠率;,环化肽和蛋白的方法,化学方法：通过化学交联等方法在N端和C端形 成二硫键，把肽头尾连接起来。缺点 是只能环化小肽。 生物合成：利用自剪接内含肽来环化肽和蛋白。,内含肽介导的蛋白环化和聚合的原理,转剪接,转剪接,环化,聚合,目的蛋白,N-内含肽,C-内含肽,线性聚合体,2.3 蛋白质修饰和蛋白质药物,2.3.1 蛋白质修饰,定义：通过化学手段改变蛋白质分子的化学结构，从而在目标蛋白上引入特定的化学基团，改变其化学功能和生物性质，以便研究蛋白质的结构和功能关系，并定向的改造蛋白质的性质和功能。 类型： 基于天然氨基酸侧链官能团的修饰 基于非天然活性基团的修饰,（1）基于天然氨基酸侧链官能团的修饰,酪氨酸、赖氨酸、色氨酸、半胱氨酸、组氨酸 N端位点的选择性修饰 C端位点的选择性修饰 特殊序列的蛋白质修饰,特殊序列的蛋白质修饰,Cys,Cys,Cys,Cys,Pro,Gly,SH,SH,SH,SH,S,CCPGCC序列,双砷荧光染料,（2）基于非天然活性基团的正交方法,酮基官能化修饰：酮基+烷氧基 腙或胯 Staudinger连接修饰：叠氮化合物和三苯基磷化合物作用生成酰胺键，反应中脱去一份子氮气形成磷的亚氨基化合物。 Click反应修饰：叠氮和炔发生环加成反应。,腙,蛋白质,N3,NH,染料,O,Cu离子,+,蛋白质,染料,两种特异性的化学反应可以在细胞裂解物、活细胞的表面甚至生物体上反应，为细胞或生物体的活体检测提供前提。 蛋白修饰上生物素后再与标记了叠氮化物的糖复合物反应，就可以用生物素抗体亲和富集出目标的糖复合物 。,蛋白质,N3,生物素,+,糖复合物,蛋白质,生物素,糖复合物,2.3.2 蛋白质药物,疾病 蛋白质 目前应用心脏病、糖尿病、自身免疫病等很多方面。,蛋白质药物可分为多肽和基因工程药物、单克隆抗体和基因工程抗体、重组疫苗。 优点： 与以往的小分子药物相比，蛋白质药物具有高活性、特异性强、低毒性、生物功能明确、有利于临床应用的特点。由于其成本低、成功率高、安全可靠，已成为医药产品中的重要组成部分。 1982年美国Likky公司首先将重组胰岛素投放市场，标志着第一个重组蛋白质药物的诞生。,A