《蛋白质结构与功能》PPT课件.ppt

第一章 蛋白质结构与功能 Structure and function of Protein,第一节 蛋白质的分子组成 第二节 蛋白质的分子结构 第三节 蛋白质结构与功能的关系 第四节 蛋白质的理化性质 第五节 蛋白质分离与纯化的基本原理,一、什么是蛋白质？ 蛋白质(protein)是由许多氨基酸（amino acid)通过肽键相连形成的高分子含氮化合物。 二、蛋白质的生物学重要性 1. 蛋白质是构成生物体的基本成分 占人体干重45%，细胞70% 2. 蛋白质具有多样性的生物学功能 1）作为生物催化剂 enzyme 2）代谢调节功能 hormone 3）免疫保护功能 Ab 4）物质的转运和储存功能 binding-component 5）运动与支持 6）参与细胞间信息传递,第一节 蛋白质的分子组成,一、蛋白质的元素组成 1、主要元素：碳（50%55%）、氢（6%8%）、氧（19%24%）、氮（13%19%）； 次要元素：硫、磷、铁、锰、锌、碘。 2、蛋白质元素组成的特点 基于：各种蛋白质的含氮量很接近：平均为16%； 体内的含氮物质以蛋白质为主。 则可通过 测N 测Pr。 即每克样品蛋白质的含量=每克样品的含氮量6.25,二、组成蛋白质的基本单位氨基酸(amino acids) 1、氨基酸（AA）的通式 H R C COOH -氨基和-羧基 NH2 2、特点： （1）20种基本氨基酸中，除脯氨酸为亚氨基酸外，其余19种均符合通式； （2）除甘氨酸的R基为H外，其余19种-碳原子为不对称碳原子，有L、 D型之分，但组成人体蛋白质的氨基酸均为L型； （3）不同氨基酸的侧链基团不同。,3、氨基酸的分类（根据侧链基团的结构和性质不同） （1）非极性疏水性AA：R为疏水基团，无极性。 Ala、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Pro、Trp 8种 （2）极性中性AA：R不带电荷，但显极性。 Gly、Ser、Thr、Tyr、 Cys、 Asn、Gln7种 （3）酸性AA：R可电离带负电荷，有极性。 Glu、Asp2种 （4）碱性AA：R可电离带正电荷，有极性。 Lys、Arg、His3种,4. 蛋白质中少见的氨基酸 羟脯氨酸、羟赖氨酸、四碘钾腺原氨酸（甲状腺素、T4） 胱氨酸,-,OOC,-,CH,-,CH,2,-,S,+,NH,3,S,-,CH,2,-,CH,-,COO,-,-,OOC,-,CH,-,CH,2,-,S,+,NH,3,S,-,CH,2,-,CH,-,COO,-,+,NH,3,半胱氨酸,胱氨酸,HS,-,CH,2,-,CH,-,COO,-,HS,-,CH,2,-,CH,-,COO,-,+,NH,3,5. 非蛋白质氨基酸 -丙氨酸、D-苯丙氨酸、同型半胱氨酸、鸟氨酸、-氨基丁酸,三、氨基酸的性质 1、两性电离性质,pH = pI 净电荷=0,pH pI 净电荷为正,pH pI 净电荷为负,(pK1),(pK2),当氨基酸溶液在某一pH值时，其所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值就称为该氨基酸的等电点(isoelectric point)。,等电点 使某种氨基酸所带正、负电荷数相等时溶液的PH值。,2、紫外吸收特性 A280nm 3、茚三酮反应：可做氨基酸的定性、定量测定。,第二节 蛋白质的分子结构,一、多肽的结构 1、肽键与肽 肽键(peptide bond)：由一个AA的-氨基与另一个氨酸的 -羧基脱水缩合生成的化学键。,肽 peptide：AA通过肽键相连形成的化合物(二肽、三肽、寡肽和多肽)。 寡肽 oligopeptide ： 一般10肽以下 多肽 polypeptide： 一般10肽以上 多肽链：由许多氨基酸借肽键相互连接而成的一种结构。 氨基酸残基：多肽链中的氨基酸，由于参与肽键的形成，已非原来完整的分子，称为。 多肽链有两端： N末端、C末端,天然存在的活性肽,类别：激素、抗菌素、辅助因子 实例：谷胱甘肽(glutathione) 短杆菌肽 促甲状腺素释放因子（TRH） -天冬氨酰-苯丙氨酸甲酯（甜味剂）,谷胱甘肽,谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还原酶的辅因子，或保护巯基酶，或防止过氧化物积累。,短杆菌肽S,促甲状腺素释放因子 （TRH）,蛋白质的分子结构 蛋白质的一级结构 蛋白质的二级结构 蛋白质的三级结构 高级结构 蛋白质的四级结构 （空间构象）,由一条肽链形成的蛋白质只有一、二、三级结构， 由二条或二条以上多肽链形成的蛋白质才可能有四级结构。,二、蛋白质分子的一级结构 1、一级结构(primary structure)：指蛋白质多肽链中氨基酸的组成及排列顺序。,2、一级结构维系键：肽键和二硫键。 3、重要性：是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。,三、蛋白质分子的空间构象(conformation) 蛋白质的构象指蛋白质分子中原子和基团在三维空间上的排列、分布及肽链的走向。 蛋白质分子的构象可分为二、三、四级结构。 维持蛋白质构象的化学键： 次级键（副键），由蛋白质分子的主链和侧链上的极性、非极性和离子基团等相互作用而形成的。 如：氢键、疏水键、离子键、范德华力、二硫键、配位键。,氢键(Hydrogen Bond)：一个已和负电性较强的原子共价结合的 氢原子与一个负电性较强的原子之间产生的静电引力。,（一）蛋白质的二级结构(secondary structure) 1. 概念：蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，即该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。 主链与侧链 由肽键和-碳原子构成的多肽链骨架称为主链，伸展在外的R基团称为侧链。 2. 主要形式： -螺旋,-折叠，-转角，无规则卷曲。 主要维系键：氢键,-螺旋(-helix)结构特点： 右手螺旋：3.6 AA/圈，螺距0.54nm 。 氢键维系（形成于每个肽键的N-H和第四个肽键的羰基氧之间）。 侧链伸向螺旋外侧。 侧链基团影响螺旋的形成和稳定。 (带同种电荷，侧链大的R基或Pro存在均妨碍-螺旋形成),-折叠,转角（-turn）,特征：多肽链中氨基酸残基n的羰基上的氧与残基（n+3）的氮原上的氢之间形成氢键，肽键回折1800 。,无规则卷曲示意图,无规则卷曲,细胞色素C的三级结构,模体(motif)/超二级结构：蛋白质分子中-螺旋、-折叠、-转角等组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的二级结构组合体，作为三级结构的单元，其基本结合形式有:,。 结构域(structural domain)：分子量大的蛋白质, 多肽链往往以超二级结构为单元组成两个或两个以上 相对独立的区域，再形成三级结构，这些相对独立的 区域称为结构域。,（二）蛋白质的三级结构(tertiary structure) 1. 概念:整条肽链中所有原子或基团的空间排布称为蛋白质的三 级结构，即多肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置。 2. 维系键:疏水作用、离子键、氢键、Vander Waals力等次级键。,三级结构的特征： 含多种二级结构单元； 有明显的折叠层次； 是紧密的球状或椭球状实体； 分子表面有一空穴(活性部位)； 疏水侧链埋藏在分子内部， 亲水侧链暴露在分子表面。,3. 三级结构的重要性： 三级结构形成后，蛋白质分子才形成固有的分子形状； 才具有亲水胶体的特性； 功能蛋白质的活性部位得以形成并表现出相应的生物学活性。,核糖核酸酶三级结构示意图,(三）蛋白质的四级结构(quarternary structure) 1. 概念:蛋白质分子中各个亚基的空间排布及亚基接触部位的布 局和相互作用,称为蛋白质的四级结构。 蛋白质分子中每条具独立三级结构的多肽链称为亚基(subunit). 2. 维系键:疏水键、氢键、离子键等次级键。,Hemoglobin,思考：四级结构中的亚基与结构域有何不同？,一、根据分子形状分类： 球状蛋白：长短轴之比10 二、根据组成分类： 单纯蛋白 结合蛋白：单纯蛋白质+辅基或非蛋白质部分 三、根据生物学功能分类 四、根据溶解度分类： 可溶性蛋白；醇溶性蛋白；不溶性蛋白,蛋白质的分类,第三节 蛋白质结构与功能的关系,一、蛋白质的一级结构与功能的关系 一级结构 空间构象 功能 1.一级结构中“关键”部分相同,其功能相同。 如：不同动物来源的胰岛素 一级结构中“关键”部分变化,其活性也改变。,Insulin of human,2. 一级结构不同，生物学功能各异。 如：催产素与抗利尿激素 S S 加压素 H2N 半胱 酪 苯丙 谷胺 天胺 半胱 脯 精 甘 催产素 H2N 异亮 亮 3 8,3. 一级结构变化与疾病的产生-分子病 如：镰刀状红细胞性贫血 Hb： 6位Glu Val,二、蛋白质空间结构与功能的关系 蛋白质前体的活化 另外，蛋白质仅构象发生改变,其功能活性也随之改变。 核糖核酸酶,2. 蛋白质的变构现象(allosteric effect): 指一个蛋白质与其配体(或其它蛋白)结合后,引起蛋白质的构象 发生改变,并伴随其活性发生改变。 协同效应:一个亚基与其配体结合后,能影响此寡聚体中 另一亚基与配体的结合。 如: Hemoglobin与Myoglobin,第四节 蛋白质的理化性质,一、两性解离和等电点 蛋白质两末端的氨基和羧基及侧链中某些基团在一定条件下均可解离. 1. 蛋白质的等电点( pI):使某一蛋白质分子所带正负电荷数 相等,净电荷为零时溶液的PH值。 蛋白质的等电点沉淀、离子交换和电泳等基本原理均以蛋白质的两性解离与等电点的特性为基础。 电泳:带电粒子在电场中向电性相反的电极移动的现象，可用于分离、鉴定蛋白质。,二、高分子性质，即胶体性质 蛋白质为分子量1万至100万的高分子物质,其在溶液中形成的质点直径在1-100nm胶体质点范围内。 蛋白质胶体稳定的因素:蛋白质颗粒表面具水化层 蛋白质颗粒表面带同性电荷 去除这两个稳定因素,蛋白质极易沉淀。 蛋白质具有分子扩散现象；布朗运动；可用超速离心法分离蛋白质；有较大的粘度，随蛋白质分子的水合作用和分子的不对称性增大而增大；不能透过半透膜，可用透析法纯化蛋白。,三.蛋白质的沉淀 1.概念：蛋白质分子聚集而从溶液中析出的现象称为蛋白质的沉淀。 2.常用的沉淀方法 （1）盐析法：(NH4)2SO4、NaCl、Na2SO4 低盐浓度可使蛋白质溶解度增加，称为盐溶作用。 高盐浓度因破坏蛋白质的水化层并中和其电荷，促使蛋白质颗粒相互聚集而沉淀，称为盐析作用。 采用不同盐浓度可将蛋白质分别沉淀，称分级沉淀；并不易发生变性。,（2）有机溶剂沉淀：乙醇、甲醇、丙酮等 （3）某些酸类沉淀： PHPI时，Pb2+， Hg2+， Ag+， Cu2+ （5）加热凝固：变性沉淀，偏酸或偏碱不易。 蛋白质的凝固作用：蛋白质经加热变成较坚固的凝块，不易再溶于强酸和强碱中，称为蛋白质的凝固作用。,四.蛋白质的变性(denaturation) 1.概念：在某些理化因素的作用下，蛋白质特定的空间构象发生改变或破坏，从而导致其生物学活性的丧失和一些理化性质的改变的现象，称为蛋白质的变性。 2.变性因素： 理：加热、高压、紫外线、超声波、剧烈震荡等 化：强酸、强碱、重金属离子、尿素、乙醇、丙酮等 3.变性的本质：蛋白质分子空间 构象的改变或破坏（二硫键和非 共价键破坏），不涉及一级结构 改变或肽键的断裂。,4.变性作用的特征：生物活性丧失；某些理化性质改变（溶解度降低，粘度增加，结晶能力消失，易被蛋白酶水解。） 5.变性作用的应用举例： 变性因素应用于消毒及灭菌，制备、保存蛋白质制剂需防止变性。 6.复性：去除变性因素后，有些变性程度较轻的蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能。 许多蛋白质的变性为不可逆变性。 变性的蛋白质易于沉淀，而沉淀的蛋白质不一定发生变性。,五.蛋白质颜色反应（可做定性或定量测定） 1.茚三酮反应 2.双缩脲反应 氨基酸无此反应 3.酚试剂反应 六. 蛋白质的紫外吸收 A280nm,第五节 蛋白质的分离与纯化的基本原理,根据溶解度不同的分离纯化方法 盐析、有机溶剂沉淀、等电点沉淀 根据分子大小不同的分离纯化方法 透析、超滤、凝胶层析、离心 根据电离性质不同的分离纯化方法 电泳、离子交换层析 根据配体不同的分离纯化方法 亲和层析,透析及超滤法,* 透析(dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。,* 超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。,丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀,*使用丙酮沉淀时，必须在04低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,*盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。,* 免疫沉淀法：将某一纯化蛋白质免疫动物可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。,电泳(elctrophoresis),蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳。 根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳等。,几种重要的蛋白质电泳: *聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) *SDS-PAGE，常用于蛋白质分子量的测定。 *等电聚焦电泳(IEF)，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 *双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。,层析(chromatography),待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。,蛋白质分离常用的层析方法: * 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 * 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。