福建农林大学分子生物学(1).ppt

Cloning vectors,Cloning vectors,plasmids bacteriophages Cosmid BAC,YAC animal and plant viruses baculovirus ,retroviruses,质粒,2-200kb 发现：细菌，偶见于链霉菌和酵母 独立于染色体之外进行复制和遗传,又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。 比病毒还简单的亚细胞结构，一旦离开寄主细胞则无法繁殖。,质粒特性： 携带编码多种基因:医学、农业、工业、 环境 细菌进化的重要因子 可以在种内或种间转移 生命和非生命的分水岭：既没有蛋白质外壳，又没有生命外细胞周期，比病毒更简单的原始生命形态，探索生命起源的重要基石。,Be capable of vectors,Replicated and isolated independently of the hosts genome exprsssion vectors: strong promoters selectable marker.,As important tools： easy to isolate easy to manipulate and transformate in vitro development for DNA clone method to express foreign genes in prokaryotes and eukaryotes,质粒的表型效应 致育性 1946年，Lederbeger发现大肠杆菌有性生殖，F质粒或性质粒（sexplasmid) 接合作用(conjugation)说明了“自然界存在着天然的基因工程“。 绿脓杆菌、抗药性因子(R因子)、大肠杆菌素因子和樟脑分解质粒、放线菌Scp1质粒,产生抗菌物质和毒素 col（大肠杆菌素因子）： 大肠杆菌素-蛋白质性质的抗菌物质； 大肠杆菌、索氏志贺氏菌、葡萄球菌 pGKL1和pGKL2：线型DNA质粒，致死效应 乳酸克鲁维酵母 scp1：产生抗生素 编码毒素： 产毒素大肠杆菌（人类和动物腹泻）； 金黄色葡萄球菌（烫伤皮肤综合症）； Bt,对药物和重金属离子抗性 R因子 R1质粒(94kb) 使宿主对氯霉(Cm)、链霉素(Sm)、磺胺(Su)、氨苄(Ap)和卡那霉素(Km)抗性 对金属离子抗性 碲 (Te+6)、砷 (As3+)、汞 (Hg2+)、镍(Ni2+)、钴(Co2+)、银(Ag+)、镉(Cd2+)等,利用异常营养物 Pseudomonas、克氏杆菌、短黄杆菌等 将许多化学毒物降解。 降解酶由降解性质粒编码 特殊有机物：樟脑、水杨酸、二甲苯、辛烷环保 对植物的致病性 Ti、Ri,其他 共生质粒：豆科植物共生固氮的根瘤菌结瘤(nod)和固氮(fix)基因 EcoRI:大肠杆菌Ry13质粒编码 乳糖的利用等特性也与质粒有关 隐秘质粒(cryptic plasmid):不显示任何表型效应的质粒,detection 如何判断细菌表现的遗传性状是染色体基因还是质粒基因编码的? 根据:质粒遗传学特性和分子结构特性,遗传学特性 a. 消除(curing) b. 遗传转移 c. 分子杂交,理化因子消除,丫淀橙、EB、利福平、丝裂霉素C、亚硝基胍、高温、紫外线 消除作用不是药物对质粒DNA的破坏，而是对DNA复制的抑制 质粒消除常自发地发生,生物学方法：原生质体形成和再生,理化因子对高度稳定的质粒消除不易奏效 用溶菌酶处理等形成原生质体，再生后菌株便以很高的频率(94%)消除了质粒，如葡萄球菌、枯草杆菌、链霉菌、沙门氏菌等。 消除机制尚不清楚，有人认为去壁形成原生质体时导致了质粒消除,另有认为质粒在原生质体再生过程中丢失的。,结构特性 DNA结构和物理学特征：质粒与染色体不同 a. 离心: 密度不同 b. agarose电泳: 分子量大小 c. 电镜观察: 1m dsDNA=3000bp d. 再转化,质粒的拷贝数 质粒拷贝数一般与其分子量成反比关系： 质粒拷贝数=质粒DNA量/染色体DNA量MWc/MWp 质粒的不相容性（incompatibility） 在没有选择压力的条件下，两种不同质粒不能共存于同一宿主细胞内的现象。 不相容质粒携带复制子基本相似，复制系统也相同，在复制和分配到子细胞的过程中相互竞争。,plasmid vectors 1、是一独立的复制子； 2、有筛选标记； 3、具有酶切位点或多克隆位点； 4、分子量小，拷贝数高。,质粒载体的设计,双抗生素 蓝白斑筛选 多克隆位点 表达载体,构建质粒载体 (1)分子量尽量小。15kb时转化效率低。 小质粒优点:容易提取； 较为抵抗机械(超声波)切割； 多拷贝，给克隆基因提供了剂量效应； 对内切酶提供多切点的机会大为减少。 (2)了解载体上基因位置/限制酶作用位点。 (3)包含可供选择的标记性状(基因) (4)应有另一个遗传标记基因（抗生素常用）， (5)最大限度地具有MCS的单切点,质粒载体多种用途,转录、测序、亚克隆、表达 转化E.coli容易，可重复性高 容易大量分离提纯,质粒载体筛选方法,插入失活 互补：IPTG,X-GAL 直接筛选：抗生素 表达筛选（抗体筛选） Probe筛选,质粒载体缺点,aCl2转化效率低 克隆片段小于kb 大量筛选时需要细胞裂解, phage vector 48.5 kb双链DNA。 cos位点（cohesive end site):在DNA两端各有12nt的5单链突出，彼此序列互补。它是包装时的切割信号。 插入型载体：在DNA非必需区插入外源片段。携带的外源片段小于2kb。 取代型载体：外源片段取代了DNA非必需区，可携带20kb的外源片段。,Cosmid vector,带有cos位点的质粒载体 4-6kb，带有选择标记，在构建cDNA文库中很有用。 可携带大的外源DNA片段，克隆 45kb真核基因。,Phasmid载体,含有噬菌体att位点（插入位点）的质粒。 含有质粒的ori和噬菌体的ori。,YAC vectors BAC vectors,Plant cloning vectors Ti质粒:侵染广泛的双子叶植物 T-DNA或T-区(T-region)：约20kb，包含专化冠瘿碱生化合成和冠瘿瘤生长的基因，随机地整合到植物染色体上。 结构特点：两端具有25个碱基对的顺向重复序列，但重复不是完全的。25个碱基对的序列称为T-DNA的边界序列(T-DNA border sequence)。去除右边界序列，将使T-DNA失去转移和整合的功能；左边界的缺失，对致瘤性无明显影响。 毒性区域即vir(virulence)区域:引起T-DNA转移的区域。长度约35kb，和T-DNA处于不同位置,转移过程：农杆菌感染后，植物细胞接受刺 激释放信号分子，反过来激活农杆菌Ti质粒上的vir基因；农杆菌粘附到植物细胞壁。植物激素诱导vir基因表达，其表达产物引起T-DNA脱离质粒，并位移进入植物细胞中,进入植物细胞的T-DNA整合并表达。 改建理由：野生型Ti质粒分子量过大、缺乏合适的克隆位点、导致植株产生冠瘿病 掌握原则:保留T-DNA的转移功能、取消T-DNA的致瘤性、通过简便手段可使外源DNA插入T-DNA之中。,CaMV克隆载体,含1个约8kb的环状双链DNA分子； 用于十字花科和少数非十字花科的植物基因转移； 其感染对植物有害，不能直接做载体； CaMV的DNA在植物细胞中能高水平转录35S RNA，其启动子是一强启动子。构建的含35S启动子的系列克隆载体可在植物细胞内高效表达基因。,Cloning vectors of animal cell 动物病毒：猿猴病毒-40(SV-40)的衍生物 5243 bp共价闭合环状分子 感染率高，几乎100寄主细胞能被感染 能提供完整的真核基因转录所需的成分 侵染性具有寄主特异性 改建：野生型最多只能包装其基因组长度的