仪器分析》第十四章分子发光光谱法.ppt

,分子发光光谱法 基本要求： 理解分子荧光和分子磷光的基本原理 理解分子荧光激发光谱、发射光谱、同步光谱和三维荧光光谱的含义 掌握分子荧光发射光谱的特性 了解荧光光谱仪的组成和各部分作用 掌握荧光分析法和磷光分析法的主要应用范围 了解化学发光分析法的原理和应用,分子发光光谱法包括： 光致发光 分子荧光 分子磷光 化学发光 生物发光,灵敏度较紫外-可见吸收光谱法高几个数量级。,1 荧光和磷光的基本机理 分子荧光与磷光的产生：,对于大多数有机物分子，其电子数为偶数，净自旋之和为S0，即基态分子为单重态（M2S+1=1）。 分子处于激发态时，某个电子可能会改变自旋方向，即自旋平行，此时S1/2+1/2=1，分子处于这样的激发态为三重态，以T表示。由于自旋平行比自旋配对的状态更稳定，因此三重态能级比单重态略低。 根据光谱选律，分子直接被激发到三重态T1的概率比较小，因为是S0T1禁阻跃迁。,分子的去激发过程 速率最快，激发态寿命最短的途径占优势。 振动驰豫受激溶质分子向溶剂分子转移过剩的能量，以10-13s10-11s的极快速度 荧光发射以10-9s10-7s左右的短时间内发射光量子回到基态的各振动能级,内部转换激发能转化为热能。其速度取决于此过程所包含的两个能态之间的相对能量差。当两个电子能级非常靠近，以至其振动能级有重叠时，内部转换十分容易发生。如两个单重激发态或两个三重激发态的较低激发态的高振动能级常常与较高激发态的低振动能级重叠，重叠的地方两激发态能量一致，内部转换效率很高，速率很快，一般只需要10-13s10-11s的时间。,外转换激发态分子与溶剂和其它溶质分子之间的相互作用即能量转换过程。它是荧光和磷光的竞争过程，因此该过程使发光强度减弱甚至消失，这种现象称为“淬灭”或“熄灭”。 体系间跨越跃迁受激分子从激发单重态转至能量较低的激发三重态。这一过程中分子的电子自旋倒转，多重性发生变化。与内部转换一样，如果两能态的振动能级重叠，这种跃迁的概率增大。,磷光发射经过系间跨越后到达激发三重态，并经过迅速的振动驰豫到达第一激发三重态（T1）的最低振动能级上，从T1态分子经发射光返回基态称为磷光发射。磷光发射属于不同多重态之间的跃迁（ T1 S0 ），是“禁阻”跃迁，因此磷光的寿命比荧光长得多，约为10-3s10s。 由于分子结构和所处环境不同，各去激发过程的速率不同。如荧光发射过程较其它过程快，则可观察到荧光现象。,荧光的量子效率 发荧光的分子数与总的激发态分子数之比,Kf荧光发射过程速率常数，主要取决于分子结构； Ki系间跨越、外转换等其他无辐射跃迁的速率常数的总和，主要取决于环境。,荧光激发光谱和发射光谱 荧光激发光谱固定发射波长，扫描激发波长得到的荧光强度激发波长的关系曲线，反映了在某一固定发射波长下，不同激发波长激发的荧光的相对效率。激发光谱用于进行荧光测定时选择恰当的激发波长。 荧光发射光谱固定激发波长，扫描发射波长得到的荧光强度发射波长的关系曲线，反映了在某一固定激发波长下，不同波长处分子的相对发射强度。荧光光谱用于进行荧光测定时选择恰当的测定波长或滤光片。,同步荧光光谱同时扫描激发和发射单色器波长的条件下，测绘光谱图，所得荧光强度-激发波长（或发射波长）曲线为同步荧光光谱。 固定波长同步扫描荧光法：= em -ex不变 固定能量同步扫描荧光法：= (1/ex -1/em)不变 可变波长同步扫描荧光法：两个单色器以不同的速率扫描 特点：光谱简化，谱带窄化，减小光谱重叠，减小散射光的影响，选择性提高，但损失其他光谱带含有的信息,并四苯的激发光谱和发射光谱（a） 同步荧光光谱=3nm（b）,三维荧光光谱20世纪80年代发展起来，以荧光强度为激发波长和发射波长的函数得到的光谱图，也称为总发光光谱，等高线光谱等。 三维曲线光谱图 平面显示的等强度线光谱图 特点：提高完整的光谱信息，可作为光谱指纹技术用于环境检测和法庭试样的判证。,（a）蒽和萘的三维荧光光谱图 （b）8-羟基苯芘的等强度光谱图,荧光光谱的特征 斯托克斯（Stokes）位移：在溶液中，荧光发射波长总是比其相应的吸收（激发）光谱的波长长，该现象是1852年由Stokes发现，因此称为Stokes位移。这种位移反映了荧光激发与发射间产生的能量损失（来源于振动驰豫和溶剂的分子的驰豫作用）。 镜像对称规则：吸收光谱形状表明了第一激发态的振动能级结构，荧光光谱形状取决于基态中各振动能级的分布情况。一般基态中振动能级与第一激发态振动能级分布是类似的，因此荧光光谱的形状和吸收光谱极为相似。,苝的苯溶液的荧光光谱和吸收光谱,荧光光谱的特征 荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关： 荧光物质发射荧光的特性之一是不管引起物质分子激发的波长是1还是2，荧光的波长都是3。 这是由于荧光分子无论被激发到哪一个激发态，处于激发态的分子经振动驰豫即内转换等过程最终回到第一激发态的最低振动能级上，而分子荧光的发射总是从该能级跃迁到基态的各振动能级上，因此其形状与激发波长无关。 反映在光谱图上就是具有一个吸收带和两个吸收带的不同物质，一般都发射一个荧光谱带（个别例外）。,分子结构 跃迁类型：*量子效率高，因为跃迁摩尔吸光系数大100-1000倍，跃迁寿命短（10-710-9s），n*（10-710-9s），其次，系间跨越速率常数小 共轭效应：稠环化合物一般发强荧光 取代基效应：给电子基团（-NH2, -OH, -OCH3, -NHCH3, -N(CH3)2等）荧光增强，吸电子基团（-Cl, -Br, -I, -NHCOCH3, -NO2, -COOH等）荧光减弱 结构刚性效应：平面刚性结构有利于荧光发射, 荧光物质吸附于固体表面可荧光增强,影响荧光强度的因素,酚酞，无荧光,荧光素，强荧光 氧桥键具有刚性平面结构,单键易旋转，非刚性平面结构,环境因素 溶剂：介电常数、折射率、氢键，极性增加，*跃迁能量减小，荧光红移 温度：温度高，碰撞频率增加，荧光效率下降 pH：酸性或碱性荧光物质影响大 荧光猝灭：与溶剂或其他分子作用，荧光减弱称为猝灭；引起荧光强度减弱的试剂称为猝灭剂。动态猝灭（碰撞）静态猝灭（形成不发荧光化合物） 内滤作用：溶液中存在吸收激发光或发射光的物质，导致荧光减弱，称为内滤（自吸是一种内滤）,影响荧光强度的因素,2-苯胺-6-萘磺酸的荧光发射光谱 A 乙腈 B 乙二醇 C 30%乙醇-水 D 水,8羟基喹啉在不同溶剂中的荧光表现,但是也有相反的情况，例如苯胺萘磺酸一类的化合物在戊醇、丁醇、丙醇、乙醇和甲醇五种不同的醇溶液中，随着溶剂极性增大，荧光效率减小。 由此可见，荧光峰的位置和强度与溶剂的关系，规律性不强，必须具体分子具体分析。,菲绕啉在联二苯中不同温度时的荧光光谱,较高的温度下，热运动加快，溶质分子与溶剂分子之间的碰撞机会增大，荧光效率下降。,金属离子与有机试剂形成的荧光配合物，受pH的影响更大。一方面影响配合物的稳定性，一方面影响配合物的组成。 例如，镓离子与邻二羟基偶氮苯在pH34溶液中形成1：1配合物，发荧光。在pH67溶液中则形成1：2配合物，不发荧光（ 1：2 型平面结构不存在） 。,散射光和拉曼光对荧光分析的影响 溶剂的瑞利散射光 容器表面的散射光 胶粒的散射光 溶剂的拉曼光,瑞利散射光溶剂分子吸收了频率较低的光线后，不足以使分子中的电子跃迁到激发态，而只是上升到基态中较高的振动能级，并在极短的时间内返回原能级，释放与原激发光波长相同的光线，称为瑞利散射光。没有能量损失，而且在所有波长发生，波长越短，瑞利散射光强度越大。 拉曼散射光和瑞利散射有关的另一种形式的散射光。它是由分子吸收了频率较低的光上升到基态中较高的振动能级后，返回到稍高于或稍低于原来的能级时发射的光，其波长较激发光波长稍长或者稍短。一般说来，拉曼散射光比瑞利散射光弱。,硫酸奎宁水溶液在320nm光激发下荧光光谱中的各类型散射峰,除了荧光峰之外，都会在空白试验中出现。因此，当荧光物质的荧光峰与激发光波长靠近甚至重叠时，散射光会严重影响方法的灵敏度，应设法减小或消除此影响。在测定前，先测空白溶液的发射光谱，然后选择合适的激发波长。溶剂的散射光随激发波长变化而变化，而荧光峰与激发波长无关，这样通过改变激发波长即可消除散射的影响。,320nm是一级瑞利散射光，640nm是二级瑞利散射光，450nm为荧光峰，360nm为水的一级拉曼光，720nm为水的二级拉曼光。,2 分子荧光光谱仪,光源氙灯和高压汞灯、激光器 单色器激发单色器和发射单色器 样品池四面透光的方形石英池 检测器光电倍增管、电荷偶合元件检测器可一次获得荧光二维光谱,3 分子荧光光谱的应用 灵敏度高，检测下限低0.10.001g/cm3，荧光分析法的应用广泛，可测定60余种元素，尤其是生物大分子的检测，还可以作为高效液相色谱及毛细管电泳的检测器。 定量分析：,FIa IaI0ItI0（110-bc） I0 （1e-2.303bc）,对于很稀的溶液，即bc 0.05，此时上面的式子中第二项以后的各项可以忽略不计，即 1e-2.303bc 2.303bc If Ia I0 2.303bc 因此，当激发光强度一定，并且溶液浓度较小时，荧光强度与荧光物质浓度之间成正比： If Kc 对于较浓的溶液，其吸光度大于0.05时，荧光强度与浓度的线性关系将出现偏离。,单组分直接测定 单组分间接测定 化学反应转化为荧光分子 荧光猝灭法 多组分的荧光测定 荧光峰不重叠，选不同的发射波长；激发光谱明显不同，荧光峰重叠，可选用不同的激发波长,无机物分析：无机阳离子本身不发荧光，可与一些有机试剂形成荧光配合物，可以测定的元素已达60多种 溶液单分子行为研究：罗丹明6G标记DNA 基因研究与检测：DNA与小分子的相互作用等 生物化学和生理医学：能测定微量氨基酸和蛋白质，还能研究蛋白质的结构，酶以及酶动力学和机理，细胞新陈代谢等 药物分析：分析低浓度的药物，6巯基嘌呤是急性白血病的重要药剂，相关分析方法还较少。用高锰酸钾将6巯基嘌呤氧化形成嘌呤6磺酸盐，即可用荧光法进行测定,4 磷光光谱法 激发单重态与激发三重态振动能级重叠时，发生系间跨越，从激发单重态转到能量较低的三重态，迅速振动驰豫到三重态最低振动能级，在10-4秒至几秒内发射磷光回到基态。 磷光和荧光都是光致发光， 同样具有两个特征光谱，即磷光激发光谱和发射光谱。 当激发光强度一定和被测物质浓度很低时，发射的磷光强度与浓度成正比。,三重态与基态间的能量差小，振动耦合强，增强了内部转换，非辐射跃迁的竞争大。 激发三重态的寿命长，同溶剂分子或其它溶质分子碰撞概率大，在室温下很少观察到磷光现象。将温度降低至液氮温度（77K），许多介质均形成刚性玻璃体，碰撞和振动耦合降至最低限度，几乎所有三重态得激发分子都会发出磷光。 室温磷光：试样固定在固体基体上、溶解在胶束溶液或环糊精溶液中，增强刚性，减少碰撞猝灭,磷光分析仪 测定磷光的仪器与荧光仪器基本相同。但为了在低温下测定，样品试液的石英管必须放在盛液氮的杜瓦瓶中。,因为发磷光的物质常常发荧光，为了将二者分开，需一个附加的机械切光器，构成磷光计。,磷光分子常用溶剂为按5：5：2比例混合的二乙醚：异戊烷：乙醇的化合物，称为EPA混合溶剂，在液氮温度时，成为透明的刚性玻璃体。 主要用于环境分析、药物研究等。例如血清或血浆中乙酰水杨酸（阿司匹林）、血清中普鲁卡因、苯巴比妥等的测定。 磷光分析对于室温下不发荧光或者荧光很弱，低温下发磷光的十分有效。 荧光光谱重叠的两组分，采用磷光分析有可能取得满意的结果。例如吲哚和色氨酸的荧光光谱几乎相同，但在低温下磷光光谱易于区分。,5 化学发光分析法 化学反应释放的能量激发了体系中某种化学物质分子，跃迁回基态产生的光发射。当化学发光发生于生物体系时，称为生物发光。 提供足够的能量 。通常是那些速度很快的放能反应，其焓变H介于150400KJ/mol之间，多为氧化还原反应。 反应历程有利，激发生成大量的激发态分子。 发光效率高。化学激发效率发射效率,化学发光的效率 化学发光的发光效率CL又称为化学发光的总量子产率： CL发光分子数/参加反应的分子数 CE EM CE为化学激发效率， EM为激发态分子的发光效率。 化学反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由参加反应的物质的化学反应决定，每一个化学发光反应都有其特征的发光光谱和发光效率。一般CL都小于0.01。,发光强度与反应物浓度的关系 化学发光的发光强度ICL与化学发光效率CL和反应物浓度之间具有如下关系：,测量任一时间的发光强度就能确定此时反应物的浓度。将上式积分，得,化学发光强度积分与反应物浓度成正比，因此可以根据已知时间内发光总量实现反应物的定量。,化学发光反应类型 直接化学发光被测物参加反应，产物发光 A+B C*+D C* C+hv 间接化学发光被测物参加反应，产物能量传给其他分子，其他分子发光 A+B C*+D C*+F C+F* F* F+hv,测空气中臭氧 没食子酸+O3 A*+O2 A*+罗丹明B 罗丹明B*+A 罗丹明B* 罗丹明B +hv,气相化学发光反应 臭氧与乙烯反应生成激发态的甲醛而发光： CH2CH2O3 HCHO*HCOOH 此反应发射光谱在300600nm，最大发射波长435nm。 臭氧与一氧化氮反应生成激发态的二氧化氮： NOO3 NO2*O2 此反应发射光谱在600875nm。同样SO2、CO等也与原子氧反应发光，主要用于大气污染监测。,液相化学发光反应 主要有鲁米诺（3-氨基苯二甲酰肼）、光泽精（N,N-甲基二吖啶硝酸盐），洛粉碱（2,4,5-三苯基咪唑）等。,H2O2,OH-,鲁米诺，发光效率0.01-0.05，最低发射波长425nm。,H2O2,OH-,N2 +,O,O,化学发光检测仪器 化学发光分析的检测仪器很简单。,化学发光反应速度很快，因此样品和反应剂的混合与测定均在光电倍增管的窗口前进行。 利用注射器等将反应剂和样品以相同的方式加入样品池，靠搅动或注射时的冲力混合，静态下测定化学发光信号，根据峰面积或峰高进行定量分析。 样品与反应剂的混合、反应以及检测过程都在流动下进行，其发光强度不能从头到尾检测，只能获得其动力学曲线的一部分，利用峰高来定量，可进行连续测定。,化学发光分析的特点 灵敏度高，特别是对于一些气体及痕量金属离子的测定，检出限可达10-9级，个别达10-12级。 设备简单，操作方便，迅速，能进行连续分析。,化学发光分析的应用： 环境监测：毒气臭氧、氮氧化物、一氧化碳、二氧化硫、硫化氢的检测可达10-9，利用金属离子催化鲁米诺等体系的化学发光可检测天然水和废水中的金属离子 指示容量滴定的终点：鲁米诺在过氧化氢和催化剂如Cu2+存在下，在pH8.0-8.5溶液中发光，可用作酸碱滴定的发光指示剂，特别适合于混浊液和深色溶液中进行的酸碱滴定。,化学发光分析的应用： 医学、生物学和生物化学领域：白细胞受外来刺激，新陈代谢加速，产生代谢中间产物而发光，可测知血清的调理功能和白细胞的氧化代谢功能，临床上用于某些免疫缺陷疾病的诊断。 发光免疫分析：在一定pH，发光物质、催化剂、氧化剂三者的浓度处在最佳比例