CD146调节肿瘤血管生成及耐药性的机制研究

密级密级:- 博士学位论文博士学位论文 CD146 调节调节肿瘤血管生成及耐药性的机制肿瘤血管生成及耐药性的机制研究研究 作者姓名作者姓名： 姜天霞姜天霞 指导教师指导教师: 阎锡蕴阎锡蕴 研究员研究员 中国科学院生物物理研究所中国科学院生物物理研究所 学位类别学位类别: 理学理学 学科专业学科专业: 细胞生物学细胞生物学 培养单位培养单位: 中国科学院生物物理研究所中国科学院生物物理研究所 二二零零一三一三年年五五月月 CD146 regulates tumor angiogenesis and drug resistance By Tianxia Jiang A Dissertation Submitted to University of Chinese Academy of Sciences In partial fulfillment of the requirement For the degree of Doctor of Cell biology Institute of Biophysics,Chinese Academy of Sciences May, 2013 I 致致 谢谢 本论文是在阎锡蕴研究员的悉心指导下完成的。五年来， 阎老师对我的学习 和生活给予了细心的指导和亲切的关怀； 阎老师为我提供了宝贵的学习机会及优 越的科研平台，我今天所取得的成果与她的殷切关怀息息相关。同时，阎老师言 传身教，她的“三自经” ： “自立，自信，自在”让我领悟到许多人生真谛，我希 望将来也能成为一名像阎老师一样“爱科研，爱生活，爱美”的女科学家。 衷心感谢我亲爱的父母二十多年来的养育之恩！ 作为一个普普通通的工薪家 庭，他们供养我一路到博士研究生，实属不易，这个中的劳苦，隐忍是我不敢想 象的。我成长中的每一次进步都凝聚着您们的汗水，爱护，鼓励与支持，也许只 有努力学习，踏实工作才是对你们最好的回报吧。还要特别感谢我的爱人郭严， 是你在我彷徨时鼓励我，默默忍耐我的任性与刁蛮，无私的给予我关爱与呵护， 正是在你的陪伴下，我顺利的完成了我博士期间学业，我坚信我们会在今后的人 生道路中继续谱写我们爱的篇章。 特别感谢这五年来陪伴我一同走过的每位实验室成员， 我们课题组是一个相 亲相爱的大家庭。感谢王玉春师傅的辛勤劳动，感谢冯静、杨东玲、卢迪、宋丽 娜老师全方位的支持，为我们的实验提供了良好的基础；感谢叶中德、梁敏敏、 王兆卿，段德民老师的指导；感谢庄洁、郑超固、张锦斌、穆彬、安云鹤、段红 霞、罗永挺，曾启群、邢澍等师兄师姐在课题和实验技能上的指导和帮助；更要 感谢王平、王飞、范克龙、凃滔、高倩、刘丹、晏荟文、吴真真等的帮助与配合。 这五年留下了很多欢声笑语和数不尽的美好回忆，令我终身难忘。同时，还要感 谢秦志海教授，松田善卫教授为我的课题研究所提供的无私帮助。 最后感谢陪伴我渡过五年博士生涯的所有老师、同学、亲人和朋友，是您们 的无私扶持让我一路顺利的走下来，祝愿你们一生平安、幸福快乐！ 姜天霞 2013 年 4 月 摘要 II 摘摘 要要 肿瘤血管生成是肿瘤发展和转移的关键步骤。目前， 抗肿瘤血管生成治疗的 关键仍然是发现新的靶分子。 我们实验室前期研究发现CD146是肿瘤新生血管标 志分子，而并非之前被认为仅仅是细胞粘附分子。后续研究发现，肿瘤条件培养 基诱导CD146二聚化，活化p38/IKK/NF-B信号通路，进而促进血管生成。这些 结果暗示CD146可能充当信号受体发挥功能。然而，其作为信号受体调节肿瘤血 管生成的具体机制尚不清楚。本论文主要阐释了这一科学问题，并初步探索 CD146在肿瘤耐药性中的作用。 第一部分主要回答CD146作为膜表面信号受体发挥功能的具体分子机制。 首 次发现CD146是VEGFR-2共受体，调节VEGFR-2信号通路，促进肿瘤血管生成。 基于这一机制， 我们构建了靶向血管生成的抗体联合治疗模型。 具体如下： 首先， 借助免疫共沉淀及体外pulldown方法，利用CD146单克隆抗体AA98及突变体 CD146/C452A工具，首次证实CD146直接结合VEGFR-2，并发现CD146胞外区第 五domain的C452位点对于维持两者相互作用是必须的。其次，生化试验发现 CD146对于VEGF诱导的VEGFR-2磷酸化，下游信号Akt，p38/IKK/NF-B活化， 体内外血管生成过程是必须的。最后，在接种人胰腺癌细胞裸鼠中构建了靶向 CD146及VEGF的抗体联合抑瘤模型，结果显示AA98及bevacizumab联合用药具 有协同效应， 抑瘤率比单独用药提高了22个百分点。本研究的创新性及科学意义 在于（1）揭示CD146作为膜表面受体促进血管生成的分子机制，获得其作为肿 瘤血管生成标志分子的最直接证据；（2）成功建立靶向血管生成的抗体联合治 疗模型，为临床肿瘤靶向治疗提供新思路及新策略。 第二部分研究主要是基于本实验室发现，CD146参与维持肿瘤干细胞特性， 暗示CD146与肿瘤耐药性相关，试图揭示CD146参与调节肿瘤细胞耐药性的分子 机制。本研究首次发现CD146能够负调控脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase， FASN）表达，后者被认为是肿瘤发生多药耐药性的主要机制之一。生化实验结 果显示，CD146对于FASN的负调节是通过抑制AKT激活进而下调固醇调节元件 结合蛋白-1的表达实现的。进一步的研究发现CD146的表达量降低能够引起多药 耐药蛋白（Multidrug Resistance Protein 1, MDR1）表达量增加，降低化疗药Dox 及5-Fu诱导的肿瘤细胞凋亡。本研究揭示了CD146通过负调节FASN的表达调控 肿瘤多药耐药性的分子机制，为临床上指导肿瘤化疗用药提供参考依据。 关键词关键词：CD146，VEGFR-2，肿瘤血管生成，脂肪酸合成酶，耐药性 CD146 调节肿瘤血管生成及耐药性的机制研究 III ABSTRACT Tianxia Jiang (Cell Biology) Directed by Xiyun Yan Tumor angiogenesis is an essential process for cancer development and metastasis, anti-tumor angiogenesis has become the hot point. Currently, it is important to identify and evaluate new targets for anti-angiogenic therapy. Previous studies show that CD146 as a novel marker of tumor angiogenesis and involved in p38 MAPKs signal transduction induced by human hepatocarcinoma cells SMMC 7721-conditional medium. These results suggest that CD146 function not only as a cell adhesion molecular but also a membrane receptor. However, the molecular mechanism of how CD146 functions as a receptor in tumor angiogenesis remains poorly understood. This dissertation mainly focus on this scientific question, also explore role of CD146 in drug resistance. In the present study, we show for the first time that CD146 is a coreceptor for VEGFR-2 in tumor angiognesis. We show that CD146 interacts directly with VEGFR-2 on endothelial cells and at the molecular level and identify the structural basis of CD146 binding to VEGFR-2. In addition, we show that CD146 is required in VEGF-induced VEGFR-2 phosphorylation, AKT/p38 MAPKs/NF-B activation, and thus promotion of endothelial cell migration and microvascular formation. An in vivo angiogenesis assay showed that VEGF-promoted microvascular formation was impaired in the endothelial conditional knockout of CD146(CD146EC-KO). Based on this mechanism, we designed a antibodies combined therapy model by dural targeting of CD146 and VEGF, anti-CD146 (AA98) and anti-VEGF (bevacizumab) show an additive inhibitory effect on xenografted human pancreatic and melanoma tumors and showed a significant inhibitory effect on the growth of the pancreatic tumor (70%) that was more efficient than AA98 (46%) or bevacizumab (48%) alone. The novelty and scientific significance of above study is (1) uncovering the mechanism of how CD146 functions as a receptor in angiogenesis, providing the direct evidence for CD146 as a biomarker in tumor angiogenensis. (2) successfully establishing antibody combined therapy model which provides a novel insight for combinatorial therapy of tumor angiogenesis. The second part of this dissertation is based on our recent research that CD146 ABSTRACT IV low expression contributes to maintaining cancer stem cell capability indicating CD146 may participate into regulating drug resistance in tumor cells. However, the molecular mechanism of how CD146 regulates drug resistance is poorly understood. One of main reseaons caused drug resistance is fatty acid synthase overpression. We for the first time uncover CD146 overexpression inhibits AKT activation, downregulats sterol regulatory element binding protein-1 (SREBP-1) expression, thus negatively regulates FASN expression. Further more, we find that CD146 knockdown by siRNA increases multidrug resistance protein 1 (MDR1) overexpression, inhibits cell apopotosis in response to Dox and 5-Fu treatment. These studies partially eluciadate that CD146 modulates drug resistance by negtively regulating FASN expression, monitoring CD146 expression level might be a novel index in effectively directing of clinical medication. Key words: CD146, VEGFR-2, tumor angiogenesis, FASN, drug resistance 文献综述 目目 录录 致 谢 I 摘 要. II ABSTRACT . III 目 录 1 文献综述 1 1. CD146 及 VEGFR-2 在肿瘤血管生成中的作用 1 1.1 肿瘤血管生成机制 1 1.2 血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）及其受体 （VEGFRs）在肿瘤血管生成中的机制 . 4 1.3 CD146 在肿瘤血管生成中的作用 18 2. 肿瘤多药耐药性 . 23 2.1 肿瘤耐药性的产生机制 . 23 2.2 脂肪酸合成酶 FASN 在肿瘤耐药性中的作用 27 研究内容 31 第一部分 CD146 在肿瘤血管生成中的作用机理研究 31 概述 . 31 1. 材料与方法 32 2. 实验结果 37 3. 小结与讨论 46 第二部分 CD146 在肿瘤多药耐药性中的作用 49 概述 . 49 1. 材料与方法 49 2. 实验结果 52 3 小结与讨论 56 参考文献 58 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果 81 文献综述 1 文献综述文献综述 1.1. CD146 及及 VEGFR-2 在在肿瘤血管生成肿瘤血管生成中的作用中的作用 1.11.1 肿瘤血管生成机制肿瘤血管生成机制 1971 年，哈佛大学医学院教授 Judah Folkman 提出肿瘤血管生成理论，即肿 瘤的生长及转移需要血管生成， 为增殖中的肿瘤细胞提供氧气及营养物质并移除 二氧化碳及代谢废物1。经过数十年的发展，肿瘤血管生成已经普遍被科学家 所接受并成为肿瘤靶向治疗研究领域的热点。2004 年，国际上第一个抗肿瘤血 管生成药物 Avastin 的问世不仅给更多的患者带来了福音，更点燃了研究者们的 热情。 因此，探寻肿瘤血管生成新靶点及其作用机制已经成为肿瘤靶向治疗领域 的研究重点。 1.1.11.1.1 血管生成过程血管生成过程 血管生成(Angiogenesis)是指在原有血管的基础上，内皮细胞以出芽或套嵌 式模式形成新的血管的过程2。具体的过程是，在胚胎发育时期，内胚层来源 的血管母细胞装配形成初始血管网络（此过程为血管发生，vaculogenesis）3， 在此基础上， 促血管生成因子作用于静止的内皮细胞使其获得迁移性而变成顶细 胞（tip cells）并促进其降解血管基底膜（BM）及细胞外基质（ECM） ，进而促 进内皮细胞出芽形成丝状伪足。顶细胞向前形成新芽以探索微环境并作为引导， 茎细胞（stalk cells）形成血管腔（lumen）并继续增殖以延伸出芽过程。顶细胞 与邻近出芽的细胞回合而形成血管回路（vessel loops）4。之后，平滑肌细胞及 周细胞等支持细胞被招募过来并包裹在初生的内皮血管上以维持其稳定性及通 透性。由此，血管成熟并形成血流，血流通过新生血管区域并带来足够的氧气， 这将导致促血管信号分子减弱，血管的出芽过程才会停止并重新进入静止期（图 1-1）5, 6。 1.1.21.1.2 血管生成分类血管生成分类 血管生成一般分为生理性血管生成（physiological angiogenesis）和病理性血 管生成（pathological angiogenesis）7。 机体在正常状况下的生理性血管生成只存在于胚胎发育，妊娠期，子宫内膜 重建期及伤口愈合过程中，以参与机体发育、组织维持与修复等过程。低氧环境 是诱导正常状态下生理性血管生成的最主要因素8。在低氧环境下，内皮细胞 将被刺激分泌低氧诱导因子（Hypoxia-inducible factors, HIFs） ，内质网相关的激 CD146 调节肿瘤血管生成及耐药性的作用机制 2 酶及可溶性鸟苷酸环化酶等分子， 从而调节组织微环境中的氧平衡以诱导血管新 生过程9。正常的生理性血管生成是在促血管及抑血管生成信号的严格调控下 进行的，新生血管会迅速成熟并进入稳定状态。 与生理性血管生成相似的是， 病理性血管生成也是低氧条件诱导的一系列细 胞的协同作用而导致的血管新生。不同的是，病理性血管生成，如肿瘤血管生成 过程失去了正调控因子与负调控因子之间的稳定平衡10。肿瘤血管生成的最大 特点是它们不再静止，并持续不断的形成新肿瘤血管，就像是一个“永远都不愈 合的伤口”11。因此，失控的肿瘤血管在形态结构上与正常的血管存在许多差 别： （1）肿瘤血管形态不规则，膨涨，扭曲，粗细不均并带有终端。它们不像正 常血管一样具有明确的动脉，静脉及毛细血管，取而代之的是这几者混乱无序的 混合样结构。肿瘤血管中的血流不规则，流动缓慢。这些特点最终造成肿瘤内部 形成缺氧及酸性条件；（2） 由于肿瘤中的血管高表达血管内皮生成因子 （VEGF） ， VEGF 通常紧密结合于内皮而使血管的通透性增高，极易发生渗漏12； （3）肿 瘤中缺乏有功能的淋巴循环系统，使新生毛细血管间质压增高，促进肿瘤细胞的 扩散与转移13, 14； （4）有研究发现，肿瘤细胞会参入到血管壁中与血管内皮 细胞相间排列，形成“马赛克血管”15。总之，肿瘤血管生成涉及肿瘤微环境 （如低氧诱导、肿瘤基质中的成纤维细胞与炎症细胞等） ，基因突变（原癌基因 激活与抑癌基因的失活）等诸多因素，是十分复杂的过程。 1.1.31.1.3 肿瘤血管生成的调节肿瘤血管生成的调节 文献综述 3 图1-1-1. 血管生成过程（图引自参考文献5，并得到许可） 。(A)血管母细胞（Angioblasts） 分化成内皮细胞 (ECs),内皮细胞形成线（cords）及初步的腔（lumen） ，进一步形成具有动 脉及静脉特性的管状结构。 (B)血管出芽步骤: (1) 顶细胞及茎细胞 （tip/stalk cell） 的选择; (2) 顶细胞导向及茎细胞增殖; (3) 形成分支（branching）; (4) 茎细胞延长，顶细胞融合，最终 血管腔形成（lumen formation） ； (5)血管成熟。(C) 原始血管(左边)到未定血管（右边） 的重塑步骤，包括形成静态而密集的内皮形态，基底膜沉积，周细胞包裹及分支停止。 经典的肿瘤血管生成调控模型是有 Folkman 教授等提出的“血管生成开关 （angiogenic switch） ”模型，这一假说在实践中被证明是正确的。这一模型指出 新生血管过程中存在一个“开关” ，开关的开启与否由促进血管生成因子 (pro-angiogenic factors)和抑制血管生成因子(anti-angiogenic factors)间的平衡所决 定16。当两者处于平衡时，开关“关闭”，平衡被打破而倾向于促血管生成方向 时开关“打开”17, 18。当受到生理刺激时，如肿瘤体积增大导致的低氧环境，肿 瘤抑癌基因的失活或原癌基因的激活，免疫炎症反应等，促血管生成因子的表达 就会上调，进而触发“血管生成开关”10。 图1-1-2. 经典的“血管生成开关”模型（图引自参考文献10，并得到许可） 。肿瘤中的增殖 性细胞与凋亡性细胞处于稳定状态时，肿瘤是一个无血管的节(休眠状态) （a） ，随后“血 管生成开关”开启，以保证肿瘤生长，这一过程以血管周细胞脱离及血管渗漏开始（b） ， 然后血管出芽（c） ，新血管生成，成熟并招募血管周细胞（d） ，最终形成肿瘤血管网络（e） 。 “血管生成开关”是一个不连续的步骤，可以发生在肿瘤进展的不同阶段， 主要取决于肿瘤类型及肿瘤微环境。 肿瘤微环境中存在的大量促血管生成因子使 “血管生成开关”长期处于“开启”状态，进而使肿瘤血管无法受到组织水平和细胞 水平的准确调节而完全失控。通常情况下， “血管生成开关”开启时以血管周细 胞的脱离及血管扩张为标志，随后新生血管持续出芽，成熟并募集血管周细胞， 最终形成肿瘤血管网络19。肿瘤血管生成伴随着肿瘤生长的整个过程，为肿瘤 CD146 调节肿瘤血管生成及耐药性的作用机制 4 的缺氧及坏死区域提供必要的养料及氧气。 1.21.2 血管内皮生长因子（血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）及其受体及其受体（VEGFRs）在肿瘤血管生成中的机制在肿瘤血管生成中的机制 VEGF 是调节血管发育，血管与淋巴管功能的关键因子。了解 VEGF 家族及 其受体酪氨酸激酶（Receptor Tyrosine Kinases，RTKs）在肿瘤血管生成中发挥功 能的机制是十分重要的。另外，VEGFR 的共受体(Coreceptors), 如神经纤毛蛋白 （Neuropilins，NRPs）及整合蛋白（integrins）可以与配体/受体信号复合体相互 作用而调节促肿瘤血管生成信号的输出。因此，靶向 VEGF 信号复合体能够有 效的抑制炎症及肿瘤发生过程中的血管生成。目前，绝大部分的抗血管生成药物 都是针对抑制 VEGF 通路所设计的。 1.2.11.2.1 VEGF 及其受体的结构与功能及其受体的结构与功能 1.2.1.1 VEGF 的结构与功能 图1-2-1. VEGFA不同亚型及VEGFRs的结构示意图 （图引自参考文献23， 并得到许可） 。 （a） VEGF-A的外显子经可变剪接产生不同亚型。VEGF结合VEGFRs的区域主要来源于外显子 2-5， 肝素结合区域来源于外显子6和7，而C末端来源于外显子8。 （b）VEGF由二硫键（红 色）共价交联形成反向平行的同源二聚体，这里所示的是VEGF-A165。 （c）VEGFR及共受 体NRP的结构，以单体形式表示（左） 。VEGF-A165将VEGFR-2及NRP-1交联在一起，主要 通过VEGFR-2的胞内区自身交互磷酸化完成（右） 。 VEGF 最初是由 Senger 等科学家于 1983 年在豚鼠肿瘤腹腔液和多种肿瘤上 清培养基中发现的，由于其能促进豚鼠血管的通透性而命名为血管通透因子 （Vascular Permeability Factor，VPF)20。随后，Ferrara 从垂体绿袍细胞培养上 文献综述 5 清液中分离出一种能够促进内皮细胞有丝分裂的蛋白因子并命名为 VEGF。 经过 cDNA 比对，两者的 cDNA 完全相同，现在习惯上称为 VEGF。VEGF 家族由五 个结构相似的因子组成，分别为 VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D 及胎盘 生长因子（placenta growth factor，PlGF） 。通常情况下，VEGF 是由二硫键共价 连接而成的同源二聚体，但是 VEGF-A 与 PLGF 之间可以形成异二聚体21。这 五种 VEGF 配体分别经可变剪接又产生不同的亚型，从而构成一个庞大而复杂 的家族。其中，VEGF-A 是血管生成中最重要的调控因子。人 VEGF-A 的外显子 经选择性剪接及翻译后加工，产生多种不同的亚型，按其所含氨基酸数目分别命 名为 VEGF-A121，VEGF-A145，VEGF-A148，VEGF-A165，VEGF-A183， VEGF-A189 和 VEGF-A20622，图 1-2-1（a）列出了 VEGF-A 的不同剪切形式 23。而 VEGF-A165 在病理性血管生成中起至关重要的作用。 VEGF-A 的表达受到缺氧，原癌基因与抑癌基因，激素等多因素的调节。缺 血缺氧环境是诱导 VEGF 表达上调最主要因素之一。缺氧时，缺氧诱导因子 1(hypoxia inducible factor 1, HIF1a)产生， 结合并激活 VEGF 启动子序列中的缺氧 诱导因子序列上，导致其 mRNA 快速和持续地表达，促进内皮细胞有丝分裂， 大量形成新生血管以改善组织供血24。另外，抑癌基因 p53 的突变或缺失，活 化的 ras、src、erbB2/neu/HER22 等癌基因也能够上调 VEGF 的表达。黄体酮、 促甲状腺素释放激素等激素均可使 VEGF-A 的表达增强。 VEGF-A 在血管生成调节中起关键作用，与伤口愈合，妊娠，维持血压，骨 骼生长等生理过程以及依赖于血管生成的炎症，肿瘤等病理过程密切相关。 VEGF-A 可由血管平滑肌细胞、 巨噬细胞和肿瘤细胞等所分泌并以自分泌及旁分 泌的形式作用于效应细胞25。肿瘤组织中的巨噬细胞和肥大细胞也能分泌高水 平的 VEGF， 以旁分泌的形式作用于肿瘤血管内皮细胞， 促进其增殖和迁移26。 1.2.1.2 VEGFRs 的结构与功能 VEGF 是通过结合跨膜形式的酪氨酸激酶受体（即 VEGFRs）发挥不同生物 学功能的。VEGF 配体以不同的亲和力结合不同的 VEGFRs，从而介导不同的功 能。VEGF 受体主要包括 VEGFR-1（fms-like tyrosine kinase 1，Flt1), VEGFR-2 （human kinase insert domain receptor，KDR 或 mouse foetal liver kinase 1，Flk1) 及 VEGFR-3（fms-like tyrosine kinase 4，Flt4)27。他们的胞外区都有免疫球蛋 白样（IgGlike domain）的结构域，胞内区含有保守的酪氨酸激酶结构域。神经 纤毛因子-1（Neuropilins 1，NRP-1）和神经纤毛因子-2（Neuropilins 2，NRP-2） 最初被发现作为 semaphorin 的受体介导神经元的导向，后被发现也能够特异的 结合 VEGF，并增强 VEGF 与其受体 VEGFR 的结合，被认为是 VEGF 的共受体 28, 29。图 1-2-1(c)为 VEGF 不同受体的结构。 CD146 调节肿瘤血管生成及耐药性的作用机制 6 VEGFR-1 主要分布在血管内皮细胞、 巨噬细胞、 单核细胞和造血干细胞30。 VEGFR-1 以两种形式存在，全长及经过可变剪接的可溶形式（sFlt1）31。 VEGFR-1 通过其胞外区的第二及第三个免疫球蛋白结构域结合 VEGF-A, VEGF-B32, 及 PlGF33。sFlt 只结合 VEGF-A，不结合 VEGF-B, 及 PlGF。有 研究发现 VEGFR-1 信号通路能够诱导肺内皮细胞产生金属蛋白酶 9 （metalloproteinase-9, MMP 9） 而加速肺转移34。 Le Counter 等人发现 VEGFR-1 以“Vascular bed-specific fashion”的形式分泌组织特异性的生长因子以行使其在 血管内皮上的功能35。在单核细胞中，VEGF 引起的单核细胞的迁移依赖于 VEGFR-1 的酪氨酸激酶区域36。而更多的研究重点是 VEGFR-1 在造血及招募 内皮前体细胞中的功能。PIGF 激活的 VEGFR-1 通过募集 VEGFR-1 阳性表达的 造血干细胞从而重建造血过程37。 VEGFR-1 对于 VEGF-A 的亲和力是 VEGF-A 与 VEGFR-2 之间的 10 倍，却起始很弱的的酪氨酸磷酸化38，VEGFR-1 更像 是一个“诱饵”受体，通过阻止 VEGF-A 结合 VEGFR-2 而负调节血管内皮细胞 上 VEGF 的活性。 图1-2-2. VEGF受体在不同效应细胞中的功能 （图引自参考文献53， 并得到许可） 。 VEGFR-1 及 VEGFR-2 表达于大多数血管内皮细胞表面。相反，VEGFR-3 主要表达于淋巴内皮细胞。 VEGF-A 结合 VEGFR-1 及 VEGFR-2，PLGF 及 VEGF-B 只结合 VEGFR-1。来源于口疮病 毒的 VEGF-E 只结合 VEGFR-2。VEGF-C，VEGF-D 结合 VEGFR-2 及 VEGFR-3。内皮细 胞的分裂增殖，血管生成及通透性等功能主要是由 VEGFR-2 介导的。相反，VEGFR1 并不 介导内皮细胞的丝裂原信号传导，而是主要在胚胎发育早期通过与 VEGFR-2 竞争结合 VEGF-A 而抑制 VEGFR-2 的功能。VEGFR-1 还能够介导单核细胞的趋化性。在造血干细胞 （HSCs）及白血病细胞中，VEGFR-1 和 VEGFR-2 也能介导趋化及增值相关的信号。 VEGFR-2 与 VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D 及 VEGF-E 结合，主要分布在血 管及淋巴管内皮细胞中，在循环性内皮祖细胞，造血细胞及巨核细胞上也有表达 文献综述 7 39。VEGFR-2 是一种 III 型的跨膜蛋白酪氨酸激酶，人源 VEGFR-2 基因编码 1,356 个氨基酸（分子量为 150 kDa） ，经过一系列的糖基化修饰后，成熟形式的 VEGFR-2 约有 230 kDa40。VEGFR-2 经可变剪接可以形成可溶性的 VEGFR-2 (soluble VEGFR2，sVEGFR2)，sVEGFR-2 表达于皮肤，心脏，脾肾，子宫等多 种组织的细胞质中。sVEGFR-2 结合 VEGF-C，阻止 VEGF-C 与 VEGFR-3 的结 合， 最终抑制淋巴内皮细胞的增殖41。 VEGFR-2 在胚胎发育初期的血管发生及 血管生成过程中高表达于血管内皮细胞及其祖细胞上42-44， 在新血管生成及肿 瘤血管生成相关的病理性过程中也有表达45, 46。基因型为 Vegfr-2-/-的小鼠由 于造血细胞及血管内皮细胞发育障碍在胚胎期的 E8.59.5 死亡47，与 Vegf-a-/- 的小鼠表型相同48, 49。 因此， 在血管生成机制中， VEGFR-2 被认为是 VEGF-A 最重要的受体，其介导的信号通路也被广泛而深入的研究。下一节详细总结了 VEGFR-2 介导的信号通路及发挥的功能。 VEGFR-3 结合 VEGF-C 和 VEGF-D，主要表达在淋巴管内皮细胞并调控淋 巴内皮细胞的生长。有研究发现，VEGFR-3 在非内皮性质的细胞上也有表达， 如成骨细胞50，神经元祖细胞51及巨噬细胞52.（图 1-2-2 列出不同 VEGFRs 结合配体的特异性，分布与功能） 。 1.2.21.2.2 VEGFR-2 介导的信号通路介导的信号通路 VEGF-A 诱导的体内促血管生成过程主要是由 VEGFR-2 介导的，其起始一 系列信号级联反应，最终影响血管内皮细胞的增殖，迁移，血管通透性，侵袭及 内皮炎症反应。 VEGF-A结合到VEGFR-2胞外的第2个与第3个IgG-like domain， 然后引起受体的二聚化和自身交互磷酸化，激活下游的信号通路53。下面将通 过介绍VEGFR-2下游的信号分子及其介导的功能这两方面来全面阐述VEGFR-2 信号通路。 1.2.2.1 VEGFR-2下游信号调节因子 1.2.2.1.1 磷脂酶C 磷脂酶 C 是 VEGFR-2 介导的增殖通路中的一个重要的接头蛋白54, 55。 人 VEGFR-2 酪氨酸 1175 （鼠 VEGFR-2 酪氨酸 1173） 是其重要的自磷酸化位点， 也被证明是磷脂酶 CSH2 结构域的结合位点。VEGFR-2 介导的酪氨酸磷酸化激 活磷脂酶 C，导致磷脂酰肌醇 4,5 二磷酸（PIP2）的水解，水解产生的肌醇 3,4,5 三磷酸肌醇（IP3）和钙离子，以及甘油二酯，反过来又促进蛋白激酶 C（PKC） 的活化，继而诱导细胞外信号调节激酶 ERK 1/2 的活性及细胞增殖56。VEGF 通过 ERK 通路调节的细胞增殖的替代机制包括结合 Grb2，直接结合 VEGFR-2 下游接头蛋白 Shc，或间接地通过支架蛋白 Gab1 和 Gab257。 CD146 调节肿瘤血管生成及耐药性的作用机制 8 VEGFR-2 依赖的磷脂酶 的活化发生在受体内化后的内体中58。苯丙氨 酸交换突变的小鼠会导致胚胎致死，这证明酪氨酸 1175/1173 对于 VEGFR-2 的 重要性59。另外，酪氨酸 1173 也结合其他的信号蛋白，包括接头蛋白 Shb 和 Sck60，因此，VEGFR-2 缺失这一结合位点也会影响其他信号通路传导。 1.2.2.1.2 Src激酶 Src 激酶家族属于胞内酪氨酸激酶， 其结构包括 N 端的特殊序列 SH3 和 SH2 结构域，PTK 结构域（催化活性中心）及 C 端保守的酪氨酸磷酸化位点。激酶 结构域的 Y416 的磷酸化会激活 c-Src 的激酶活性，然而 C 末端的 Y527 的磷酸 化会导致同一分子内的 pY527 结合 SH2 结构域从而削弱激酶活性61, 62。含有 SH2结构域的T 细胞特异接头蛋白 （T cell-specific Adaptor， TSAd） 集合VEGFR-2 的 Y951（鼠 Y949） ，从而激活下游的 c-Src63。活化 c-Src 的机制还包括结合 VEGFR2 激酶结构域 Y1059 或支架蛋白 Gab1 和 Gab264。Src 激酶家族会以配 体非依赖途径自身磷酸化后活化受体酪氨酸激酶进而起始下游信号。Src 激酶家 族会磷酸化粘附连接处的血管内皮细胞钙依赖性粘附素(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)，从而增强内皮细胞的通透性65, 66。Src 激酶的底物还 包括调控细胞骨架的蛋白， 如 paxillin, talin1, p120 catenin, cofilin 及 cortactin， 表 明 Src 家族能够广泛影响内皮细胞的生物活性67。 1.2.2.1.3 局部粘连斑激酶（FAK） 非受体酪氨酸激酶性质的 （FAK）是调节内皮细胞形态，迁移，连接完整性， 增殖及存活的重要调控因子68。 FAK 位于细胞与胞外基质的紧密连接处从而使 细胞整合连接到胞外基质。FAK 的活化包括 Y397 的自磷酸化和紧接地由 Src 介 导的 Y576，Y577，Y861 和 Y925 的磷酸化。VEGFR-2 通过 c-Src，Shb 和 RhoA 或者通过直接与集群的整联蛋白相互作用促进整合连接过程中 FAK 的活化。这 一些列的反应是通过 integrin 与 VEGFR-2 间的直接相互作用或 VEGFR-2 下游的 c-Src，Shb 或 RhoA 介导完成的69, 70。在内皮细胞中 FAK 下游的效应分子包 括磷酸肌醇 3 激酶（PI3K）和 ERK71。胚胎期内皮细胞特异的 FAK 失活会导 致血管缺陷，内皮细胞凋亡及伪足形成缺陷继而导致胚胎致死（在胚胎期 10.5-13.5 天） 72。 成年小鼠内皮细胞特异的 FAK 缺失导致血管通透性降低73。 1.2.2.1.4 PI3K- AKT通路 PI3K 是血管生成的重要调控因子74。VEGF-A 能通过几种途径活化 AKT， 包括 FAK，Shb，Gab，IQGAP1 和 TSAd/Src/Axl,或者通过 PI3K 与 VEGFR2 的 pY1175 直接相互结合75。PI3K 与内皮细胞体外成血管76，增殖，存活和血 文献综述 9 管通透性相关77。 Rho 家族的 G 蛋白和 AKT 被认为是 PI3K 下游的重要效应分 子78。 AKT（也被称为 PKB）是 PI3K 下游的信号中间体。AKT 在内皮细胞中以 三种亚型存在， Akt1-3。 PI3K通过磷酸肌醇依赖激酶1 （phosphoinositide-dependent kinase 1， PDK1） ， 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白激酶 2 （mammalian target of rapamycin C2，mTORC2）以及抑制磷酸酶 PTEN 来激活 Akt79。活化的 Akt 主要是通过 影响内皮细胞存活，增殖，血管通透性，基质金属蛋白酶（MMP）的合成和释 放以及赋予内皮细胞炎症性质来影响血管新生80。内皮细胞中 Akt 的持续活化 会引起肿瘤血管的扩张和高渗81。 Akt1 这一亚型在正常血管发育和淋巴管新生 中起到非常重要的作用82。Akt 下游的靶向分子包括：1）Bcl2 相关的死亡启动 子 BAD；2）调控血管直径的 eNOS 合酶；3）调控细胞周期蛋白和 MMPs 表达 的糖原合酶激酶（GSK）-3；4）调控 NF-B 并促进炎症反应的 IKK；5）增强 蛋白质合成功能的 mTORC1；6）促进抗凋亡反应的转录因子 FOXO78。 1.2.2.1.5 Rho家族小G蛋白 Rho家族包括Rho， Rac和Cdc-42， 主要调节细胞形态和运动能力83。 Cdc-42 参与丝状伪足的形成，RhoA 参与组装局部粘连斑和形成应力纤维。Rac 主要在 片状伪足的形成过程中发挥作用。鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEFs）和 GTP 酶激 活蛋白（GAPs）调节小 G 蛋白在与 GTP 连接的活化形式和与 GDP 连接的非活 化形式之间的转换，进而调控 G 蛋白活性。VEGFA 刺激引起 Rho84，Rac85 和 Cdc-4286活化。激活的 Rho 通过局部粘连斑组装刺激 FAK 的活化。许多研 究表明 Rac 与内皮细胞的很多功能相关。内皮细胞特异性 Rac 敲除的小鼠由于 血管新生受损导致胚胎期第 9.5 天死亡，说明 Rac 在调节内皮细胞功能中的关键 作用87。成年小鼠中，Rac 与缺血恢复相关88，然而其仅在V3 缺失的情 况下对于肿瘤血管新生是必需的89。脂质鞘氨醇 1-磷酸刺激血管新生主要依赖 Rac 活化及 “正常化”（使血管成熟及非渗） VEGF-A 刺激的血管新生90。 VEGF-A 刺激的血管通透性正常化依赖于促血管生成素-1（Angiopoietin-1） ，这一过程是 通过 Rho 阻断 Src 激酶结合 mDia（半透明同系物）以降低 VEGFA 激活 Rac 激 活完成的91。另外，VEGFA 刺激的血管通透性需要 Rac 的参与84。相应地， 下游 PAK 被活化并且磷酸化 VE-cadherin 从而导致内皮粘连处的解组装。因此 Rac 可以导致内皮粘连处的闭合和开放，这取决于其所处的血管生成环境92。 Rac 可以被多种 GEFs 激活。RhoG 是在内皮细胞中发挥功能的一种 Rac-GEF93， 但这种GEF是否对VEGF-A激活的Rac的活性有影响还不得而知。 另一方面，Rac1-GEF Vav2 已被证明参与内皮细胞上 VEGF 激活的 Rac1 的活化 与非活化两种状态的转换。非内皮细胞中，FAK 可能通过 Rac-GEF Tiam1 增加 CD146 调节肿瘤血管生成及耐药性的作用机制 10 Rac 活性和定位94, 95。 1.2.2.1.6 钙调磷酸酶及活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T cells， NFAT） PLC活化导致 Ca2+的流动，引起钙调磷酸酶依赖的 NFAT 的活化，从而导 致“炎症反应”相关基因的转录改变，如白细胞介素 1（IL-1） 。NFAT 信号也与 VEGF-A 诱导的 eNOS 表达和 NO 产生有关96。钙调磷酸酶的抑制子 DSCR1 具有对 VEGFA-NFAT 的负反馈调节作用。 许多研究表明， VEGFA 可以通过提高 胞浆中的 Ca2+含量和激活 PKC来上调 DSCR1 的表达97。 过表达或是特异性的 敲除 DSCR1 都会抑制血管新生 （包括体外内皮细胞迁移、 成管和体内血管新生） 从而抑制肿瘤生长98。由于 DSCR1 存在两种亚型，一种是抑制内皮细胞增殖 的 Ex4，另一种是促进血管新生的 Ex1，以至于 DSCR1 是发挥促或抑血管生成 功能仍不确定99。 1.2.2.1.7 ROS ROS是VEGFR2激活的NADPH氧化酶（Nox）下游分子。表达Nox1，Nox2， Nox4和Nox5的内皮细胞会利用一种NADPH依赖途径产生能被过氧化物歧化酶 催化生成过氧化氢的超氧阴离子。在很多情况下，这一过程可被Rac和经PKC， Akt，Src激酶，MAPK，PAK磷酸化的p47phox激活100，而且这些分子都能调 节内皮细胞的生物活性。其中Rac依赖的调节作用不仅与p66Shc有关并且还与线 粒体产生的ROS相关。Nox1敲除会降低小鼠内皮细胞的迁移能力以及体内的血 管 新 生 ， 并 且 伴 随 着 过 氧 化 物 酶 体 增 殖 物 激 活 受 体 （ peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR）的表达增加和依赖于VEGF的NF-B的活性 降低101。这些在转录水平上的改变会降低VEGFA和MMP-9的表达。VEGFA诱 导的VEGFR2和Src直接氧化依赖于p47phox，最终激活Akt信号。下调p47