饲料添加剂(I)粪肠球菌质量内控标准提供伟嘉版本.doc

DBNF-SW-5-Y005北京大北农科技集团股份有限公司内控标准 饲料添加剂（）粪肠球菌质量内控标准 2013-6-16发布 2013-7-1实施 北京大北农科技集团股份有限公司 发布前 言本标准由北京大北农科技集团股份有限公司提出并起草。本标准主要起草人：刘雪连本标准于2013年7月首次发布饲料添加剂（）粪肠球菌质量内控标准1 范围本标准规定了粪肠球菌产品的要求、检验方法、检验规则、标签、包装、运输和贮存。本标准适用于本公司生产的粪肠球菌饲料添加剂。2 规范性引用文件下列文件对本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 4789.3-2003食品卫生微生物学检验 大肠菌群测定GB/T 14699.1-2005饲料 采样GB/T 5917.1-2008饲料粉碎粒度测定法GB/T 6435-2006饲料中水分的测定GB 10648饲料标签GB/T 13079-2006饲料中总砷的测定GB/T 13080-2004饲料中铅的测定 原子吸收光谱法GB/T 13091-2002饲料中沙门氏菌的检验方法GB/T 14699.1-2005饲料采样方法GB/T 18823-2002饲料检测结果判定的允许误差JJF 1070-2005定量包装商品净含量计量检验规则国家质量监督检验检疫总局第75号令（2005）定量包装商品计量监督管理办法3 术语和定义下列术语和定义适用于本标准。3.1 杂菌数指在选择培养基上，除粪肠球菌外的其他细菌和霉菌菌落数之和。3.2 杂菌率指杂菌数在目的菌种数和杂菌数之和中所占百分率。4 要求4.1 感官指标表1粪肠球菌的感官要求产品名称项目指标色泽气味杂质外观DBN粪肠球菌原粉淡黄色至黄褐色粉状具有乳酸特有的酸甜味，无腐败，无异臭味无异物粉末状DBN粪肠球菌可溶原粉淡黄色至黄褐色粉状具有乳酸特有的酸甜味，无腐败，无异臭味溶解度大于95%，无异物粉末状DBN粪肠球菌菌粒乳白色至淡黄色颗粒状具有乳酸特有的酸甜味，无腐败，无异臭味无异物颗粒状或条状4.2 理化指标理化指标应符合表2的规定。表2粪肠球菌理化指标产品名称项目指标孔径水分粪肠球菌活菌数(108个/g)DBN粪肠球菌原粉7%500DBN粪肠球菌可溶原粉7%500DBN粪肠球菌菌粒0.8mm10%5004.3 卫生指标标准名称卫生指标应符合表3的要求。表3 粪肠球菌卫生指标项目指标杂菌率0.1%致病菌（肠道致病菌或致病性球菌）不得检出总砷（以As计）（mg/kg）2.0铅（以Pb计）（mg/kg）5.0其它卫生指标符合NY/T 1444 2007中4.1.3的规定4.4 净含量按国家质量监督检验检疫总局第75号令执行。5 检验方法本标准使用的水，在未注明其他要求时，应符合GB/T 6682中三级用水的要求。本标准所使用的试剂，在未注明规格时，均为分析纯（AR）。如有特殊要求另作明确规定。5.1 抽样按GB/T 14699.1-2005的规定，进行样品的采集。采样时必须特别注意样品的代表性和避免采样时的污染。首先准备好灭菌容器和采样工具，如灭菌牛皮纸袋或广口瓶，金属勺和刀。在卫生学调查基础上，采取有代表性的样品。样品采集后应立即进行检验。5.2 感观检验取一定量（固态250g、液态250ml）的样品于无色玻璃杯中，采用目测、鼻嗅的方法进行检验。5.3 水分测定按GB/T 6435-2006规定方法测定。5.4 成品粒度测定按GB/T 5917.1-2008规定方法测定。5.5粪肠球菌检测按附录A（规范性附录）执行。5.6 卫生检测5.6.1砷含量测定按GB/T 13079-2006规定执行。5.6.2 铅含量测定按GB/T 13080-2004规定执行。5.6.3 霉菌检测按GB/T 13092规定执行。5.6.4 细菌总数按GB/T 13093规定执行。5.6.5 致病菌检测按GB/T 13091-2001、GB/T 4789.5-2008和GB/T 4789.10-2003规定执行。5.6.7 杂菌率计算公式：5.7 净含量按JJF 1070-2005规定执行。5.8 监测与仲裁判定检测结果判定的允许误差按GB/T 18823-2002规定执行。6 检验规则6.1 检验分类产品的检验分为出厂检验和型式检验两类。6.2 组批与取样6.2.1 组批：同品种、同一生产线、同一天内生产的同一批料为一批。6.2.2取样：按GB/T14699-2005方法取样，每批产品包装袋数为1-4时，每袋取样；每批产品包装袋数为5-16袋时，最少取4袋；每批产品包装袋数大于16袋时，最少取袋。每批取样量不少于0.5kg。6.3 出厂检验感官指标、水分、粒度、微生物含量（含活菌数和杂菌率）指标为出厂检验项目，产品出厂前必须由公司质检部门检验合格并出具合格证，方可出厂。6.4 型式检验6.4.1一般情况下，企业半年进行一次型式检验。但有下列情况之一时，亦须进行型式检验。a） 产品成批出厂前；b） 原料、配方、生产工艺及设备有重大变化时；c） 产品停产3个月以上需要重新恢复生产时；d） 国家质量监督机构要求进行质量抽查时。6.4.2 型式检验项目：第4章所规定的全部项目。6.5判定规则6.5.1 在保证产品质量的前提下，生产厂可根据工艺、配方、设备、原料等变化情况，自行确定出厂检验的批量。6.5.2检验时如产品已霉烂变质、有明显结块或有致病菌检出，卫生指标不合格，则判定该批产品为不合格产品，不得复检；6.5.3 活菌指标若低于表2规定值的80%者为不合格项，允许在原样本中加倍取样复检，以复检结果为依据。若仍有不合格项，则判定该批产品为不合格产品。7 标签、包装、运输、贮存、保质期7.1 标签采用鲜明的标签贴于外包装，标签内容应符合GB 10648的规定要求。7.2包装包装为铝箔袋、纸箱包装或纸塑复合袋包装。包装应符合运输和贮存的要求。7.3 贮运 贮运过程中防雨、防潮、防止日光暴晒。不得与有毒有害或其它污染物品混装、混运。7.4 贮存产品应贮存在凉爽、通风、干燥的库房内，或阴凉贮存。不得与有毒有害或其它污染物品混贮。7.5保质期 在符合贮存运输的条件下，自生产日期起保质期为12-15个月。附录A（规范性附录）粪肠球菌检测方法A1 范围生产分析和质量控制部门适用。A2 原理细菌呈球状、球杆状，0.5-0.8m,常成对或短链状排列，无芽孢，革兰氏染色阳性。在血平板上菌落呈针尖大小、灰白色、圆形、表面光滑凸起、溶血。在葡萄糖肉汤中呈均匀混浊生长。革兰氏阳性，过氧化氢酶呈阴性，能在6.5%氯化钠肉汤、pH9.6葡萄糖肉汤及45生长，能分解葡萄糖产酸不产气，发酵山梨醇，不发酵阿拉伯糖，硝酸盐还原阴性，精氨酸双水解阳性，最适生长温度36，最适pH4.7-7.6。A3 试验方法A3.1 仪器设备和材料A3.1.1 生物显微镜（10100）A3.1.2 菌落计数器A3.1.3 恒温培养箱（361）A3.1.4 恒温干燥箱A3.1.5 恒温摇床A3.1.6 灭菌锅A3.1.7 无菌室或超净工作台A3.1.8 酸度计A3.1.9 架盘药物天平：0-500g，精度至0.5gA3.1.10 试管：15mm150mm 18mm180mmA3.1.11 灭菌培养皿：直径9cmA3.1.12 三角瓶：500mlA3.1.13 无菌吸管：1ml(具有0.01ml刻度) 5ml，10ml（具有0.1ml刻度）A3.1.14 玻璃刮刀或L型玻璃棒（涂布棒）A3.1.15 灭菌牛皮纸袋或广口瓶，金属勺和剪刀A3.1.16 酒精灯A3.1.17 载玻片A3.1.18 镊子A3.1.19 接种环、接种针A3.1.20 均质器或微型振荡箱A3.2 培养基和试剂A3.2.1 除特别注明外，试验中所有试剂为分析纯试剂，水为蒸馏水或相应程度的水，溶液为水溶液。A3.2.2 BPY琼脂培养基（配置方法见附录B1）A3.2.3 血琼脂培养基（配置方法见附录B2）A3.2.4 pH9.6的肉汤培养基（配置方法见附录B3）A3.2.5 耐盐试验培养基（配置方法见附录B4）A3.2.6 40%胆汁肉汤培养基（配置方法见附录B5）A3.2.7 糖类发酵培养基（配置方法见附录B6）A3.2.8 硝酸盐培养基（配置方法见附录B7）A3.2.9 索恩利氏培养基（配置方法见附录B8）A3.2.10 革兰氏染色液（配置方法见附录B9）A3.2.11 解囊液（配置方法见附录B10） A3.2.12 乳酸纸层析法（配置方法见附录B11）A3.2.13 格里斯氏试剂（配置方法见附录B12）A3.2.14 二苯胺试剂（配置方法见附录B13）A4 粪肠球菌菌落数检测A4.1 检验程序如下检 样用无菌水做成几个适当倍数稀释液选择2-3个适当稀释度各0.1ml，加入富集培养基平皿 361 培 养24小 时 菌 种 鉴 别 检 验 菌 落 计 数 报 告A4.2 操作步骤A4.2.1 采样A4.2.1.1采样时必须特别注意样品的代表性和避免采样时的污染。首先准备好灭菌容器和采样工具，如灭菌牛皮纸袋或广口瓶，金属勺和刀，采取有代表性的样品，样品采集后应尽快检验，否则应将样品放在低温干燥处。A4.2.1.2以无菌操作称取经过充分摇匀的待检样10克移入含有90毫升解囊液（按本标准附录B10规定执行）的灭菌三角瓶内，并于振荡器中恒温振荡培养器中36,200rpm预处理30分钟，做成1:10的均匀稀释液，混合均匀。A4.2.1.3用无菌吸管吸取1:10稀释液1.0ml加到含有9.0ml无菌水的试管中，并于微型振荡器中8000-10000转/分钟处理2-3分钟，充分摇匀制成1:100的稀释液。A4.2.1.4 用无菌吸管吸取4.2.1.3的稀释液1.0ml加到含有9.0ml无菌水的试管中，进行10倍梯度稀释，并于微型振荡器上混合3min。每个稀释度换用一支1.0ml灭菌吸管，按上述操作程序进行10倍递增稀释直至10-8。A4.2.2 平板计数法A4.2.2.1估计样品的含菌量，选择三个连续稀释度，分别在作10倍稀释的同时，各取0.1ml分别加到计数培养基平皿，均匀涂布，各个稀释度作3个平皿，最好同时作2种培养基，同时作无菌水空白对照。以上操作全过程需在20min内完成。A4.2.2.2 将平板倒置于36恒温中培养，培养24小时后观察菌落特征。A4.2.2.3 选取具有30-300个典型菌落的平板，进行计数。并计算同一稀释度三个平板的平均菌落数。A4.2.2.4根据证实试验确定为粪肠球菌的菌落数，按比例计算出该皿内的粪肠球菌的菌落数，然后乘其稀释倍数再乘以10，即得每克（或ml）样品所含粪肠球菌数并作出报告。例：将检样10-6稀释液0.1ml涂布于选择富集培养基平板上，生成的可疑菌落数为35个，取5个进行鉴定，证实为菌粪肠球菌菌的是4个，则1g样品中菌粪肠球菌菌数为（354/5）10610=1.2108。A4.2.2.5计数后，将可疑菌落、目标菌落分别接种于营养琼脂斜面，与37培养24小时，进行粪肠球菌鉴定试验。A5 粪肠球菌的鉴定A5.1在pH9.6的肉汤培养基上的生长试验挑取A4.2.2.5小节中选定菌落的菌苔，接种葡萄糖肉汤（pH9.6）液体培养基，并将未接种的空白作对照，于36培养1824小时，观察生长情况，培养基有混浊物为阳性。粪肠球菌能够在pH9.6的肉汤培养基上的生长。A5.2耐盐试验挑取A4.2.2.5小节中选定菌落的菌苔，接种耐盐培养基，并将未接种的空白作对照，于35培养3-7天，与未接种的对照管对比，观察培养液的混浊情况，记录试验结果。粪肠球菌能够在6.5%NaCl的培养基上生长。A5.3 耐胆盐试验挑取A4.2.2.5小节中选定菌落的菌苔，接种40%胆汁肉汤（pH9.6）液体培养基，置35培养24-48小时，观察有无细菌生长。阳性菌呈颗粒状生长，上液澄清，管底有沉淀；阴性菌则不生长。粪肠球菌为阳性，可以生长。A5.4 葡萄糖产酸和产气试验挑取A4.2.2.5小节中选定菌落的菌苔，接种乳酸菌葡萄糖发酵培养基，并将未接种的空白作对照，于36培养2 -3天，观察记录。若产酸则培养基变黄色，并可用pH计测定pH值，用纸层析法检查是否为乳酸。若产气则德培拉姆氏小试管中有气泡。粪肠球菌发酵葡萄糖产乳酸不产气，pH可达4.1-4.6，发酵山梨醇，不发酵阿拉伯糖。A5.5 硝酸盐还原试验挑取A4.2.2.5小节中选定菌落的菌苔，种硝酸盐培养基，并将未接种的空白作对照，于35培养3天，在干净的比色瓷盘小窝中倒入少许已接种培养的培养液，再滴一滴格里斯氏试剂的A液及B液。在对照中同样加入格里斯氏试剂的A液及B液各一滴。观察并记录溶液是否变色，若变红色则为阳性，若无红色出现，再加入一滴二苯胺试剂，如溶液变为蓝色则为阴性，不变蓝色，则为阳性。粪肠球菌为硝酸盐还原阴性。A5.6 精氨酸双水解酶测定试验挑取A4.2.2.5小节中选定菌落的菌苔，穿刺接种索恩利氏培养基，并用灭菌的凡士林油封管，并将未接种的空白作对照，于35培养3、7、14日观察，培养基转为红色者为阳性，不变者为阴性。粪肠球菌的精氨酸双水解酶测定试验呈阳性。A5.7 结果解释及报告符合粪肠球菌群的特征，有较强的耐盐性、耐胆碱性、能在pH9.5的培养基上很好的生长、葡萄糖发酵产酸不产气、发酵山梨醇、不发酵阿拉伯糖、硝酸盐还原阴性、精氨酸双水解酶测定试验呈阳性，则可报告为粪肠球菌。对偶尔遇到的一些少数可疑菌株，可以根据需要进行其他试验。附录B（规范性附录）专用培养基和试剂B1 BPY琼脂培养基葡萄糖 5g酵母膏 5g氯化钠 5g大豆蛋白胨 10g牛肉膏 5g碳酸钙 0.7g蒸馏水 1000mL按以上配方配制培养基，溶解后用40%的氢氧化钠溶液调pH为6.8-7.0，高温蒸汽灭菌锅121，20min灭菌。B2 血琼脂培养基蛋白胨 10g葡萄糖 2g氯化钠 5g磷酸二氢钾 2.5g柠檬酸钠 5g脑浸汁 800ml猪心浸汁 200ml羊血 10%pH 7.2注：猪心和猪脑浸汁法：（1）新鲜猪心除去心头和脂肪，搅碎100克加蒸馏水至1000ml；（2）新鲜猪脑除去血管，取200g加蒸馏水至1000ml；（3）50保温1小时，然后煮开15min;（4）冷却后用纱布过滤备用。B3 pH9.6的肉汤培养基pH9.6的肉汤 100ml葡萄糖 2g/L注：将普通肉汤调整pH9.6，加入葡萄糖溶解后，分装试管，每管23ml，121灭菌15min,备用。B4 耐盐培养基蛋白胨 10g牛肉膏 3g氯化钠 65g蒸馏水 1000ml将上述成分溶解后，调节pH7.0，分装试管，高压灭菌12115min20min，冷至45，备用。B5 40%胆汁肉汤培养基 蛋白胨 10g 氯化钠 5g牛肉浸膏 5g 新鲜胆汁（猪、牛） 400ml 蒸馏水 600ml 先将蛋白胨、牛肉膏、氯化钠加热溶于蒸馏水中，调pH至7.6，加入胆汁混匀后，分装试管，每管3ml，置115灭菌20min，冷藏备用。取新鲜猪（牛）胆若干只，取胆汁用纱布过滤，装于瓶中115灭菌20min,冷却后置4冰箱内，次日取出吸取上清液备用。B6 糖类发酵培养基B6.1 基础培养基 蛋白胨 1% 酵母膏 0.5% 吐温80 0.1%（v/v） 盐溶液A 0.5%（v/v） 盐溶液B 0.5%（v/v） 溴甲酚紫（1.6%水溶液） 约1.4ml 盐溶液A： KH2PO4 10g K2HPO4 10g 蒸馏水 100ml 盐溶液B: MgSO47H2O 11.5g MnSO42H2O 2.4g FeSO47H2O 0.68g 蒸馏水 100mlB6.2 以上成分溶解后调pH到6.8-7.2，分装试管。121高压灭菌20-30min。B6.3 葡萄糖、阿拉伯糖、山梨醇各10gB6.4 将山梨醇和阿拉伯糖配制成10%的水溶液，经过滤灭菌后用无菌操作加到无菌基础培养基中。B7 硝酸盐培养基牛肉蛋白胨培养基 1000ml KNO3 1g培养基配制好后，调节pH7.0-7.6，分装试管，每管4-5ml，121蒸汽灭菌15-20min,冷至45，备用。B8 索恩利氏培养基蛋白胨 1gNaCl 5gK2HPO4 0.3g洋菜 6 g酚红 0.01gL-精氨酸盐 10g蒸馏水 1000ml将以上成分加热溶解，调节pH7.0-7.2，分装试管，每管4-5ml，121蒸汽灭菌15-20min, 冷至45，备用。B9 革兰氏染色法B9.1 结晶紫染色液结晶紫 1g95%乙醇 20ml1%草酸铵水溶液 80ml将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。B9.2 革兰氏碘液碘 1.0g碘化钾 2.0g蒸馏水 300.0ml将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振荡，待完全溶解后，再加蒸馏水至300ml.B9.3 沙黄复染液沙黄 0.25g95%乙醇 10.0ml蒸馏水 90.0ml将