微生物研究法D组.ppt

微生物研究法D組,報告者：曾仁志 報告日期：2005/9/19,題目：(1)CO2、Sodium bicarbonate和 HEPES buffer對培養基pH值的調控。 (2)成立一個細胞學實驗室需要什麼需求。,培養基pH值的變動對細胞造成的影響,哺乳動物細胞最適生長的pH範圍為7.27.4，過酸或過鹼都會對細胞生長不良或造成傷害，故讓培養基的pH值穩定是相當重要。 For example： Articular Chondrocytes(關節軟骨細胞)，主要的能量來源是透過糖解作用之無氧代謝，Pyruvate轉換成 lactic acid，會迅速酸化培養基而導致抑制細胞生理及代謝。,Glucose,Glycolysis,Glucose-6-phosphate,Pyruvate,Lactic acid,pH,Cell,CO2、Sodium bicarbonate和 HEPES buffer對培養基pH值的調控,培養基的pH buffer system最常用NaHCO3加入培養基中，以CO2來調整pH在適當之範圍 (HCO3- + H+ H2CO3 CO2 + H2O)。 細胞生長需要CO2的環境，然而在CO2 incubator不斷的補充CO2下，培養基會越來越酸。加sodium bicarbonate進去，使HCO3- 去抓住H+ 來平衡pH值。然而在細胞生長快速及carbonic anhydrase的存在下，培養基會酸化的更快，故以添加HEPES來穩固細胞生長最適之pH的環境。,CO2、Sodium bicarbonate和 HEPES buffer對培養基pH值的調控,以HEPES當培養基之緩衝液之優缺點,優點：對細胞毒性較小，適用於多種類型細胞的培養。(參見表一),盡可能避免光照,缺點：長期暴露於光照下，會產生具細胞毒性之自由基。(但是只要避光保存便可避免，此問題較易解決。),參考資料,表一、各種常用緩衝液及其使用範圍,Phosphate buffer with or without Ca2+,Phosphate buffer without Ca2+： 多應用於細胞培養之沖洗。 With or without Ca2+ ? Why ?,Phosphate buffer with or without Ca2+,Phosphate buffer與鈣離子結合沉澱的原因： 溶液的pH值 在溶液中，磷酸鹽是以三價的磷酸根（PO43-）、二價的磷酸氫根（HPO42-）和一價的磷酸二氫根（H2PO4-）存在，這三個離子會維持一個平衡的狀態，但是PO43-要在強鹼（pH值很大時）的情況下才會存在，所以在phosphate buffer溶液中只可能以HPO42-及H2PO4-存在。 HPO42-較會和鈣離子產生沉澱。在pH值7.4時會有80%的HPO42-存在，較會和鈣離子產生沉澱；若pH值下降至5.4時，則有96%的H2PO4-的存在，這樣一來就減少產生磷酸鈣沉澱的機會。所以溶液pH值影響鈣磷沉澱很大，pH值較低時，發生沉澱的機會也較低。,Phosphate buffer with or without Ca2+,成立一個細胞學實驗室的基本需求,設計細胞實驗室之基本考量 細胞培養最害怕的就是污染的問題，因此提供一個無菌的設備、環境及無菌操作技術是十分重要的。,UV殺菌燈,設計細胞實驗室之基本考量,無菌操作臺,滅菌器,設計細胞實驗室之基本考量,細胞培養室與其他工作室隔離，需有23道門，要有緩衝區來更換鞋子與實驗衣。,Air shower,設計細胞實驗室之基本考量,細胞培養箱、冰箱、桌上型離心機、顯微鏡等設備 。,Incubator,冰箱,細胞實驗室之基本配備,離心機,顯微鏡,細胞實驗室之基本配備,其他設備 1.水浴槽 2.液態氮 3.-20 、-80 、4 等冰箱。 4.其他的視實驗需求而定。,參考文獻,Fisk A., Pathak S., (1969) HEPES-buffered medium for organ culture. Nature. 224, 1030-1031. Waldman S.D., Couto D.C., Omelon S.J., Kandel R.A., (2004) Effect of sodium bicarbonate on extracellular pH, matrix accu