影响免疫组化染色的因素及对策.ppt

影响免疫组化染色的因素及对策,良好的免疫组化染色切片是正确判断染色结果的基础和前提。由于免疫组化染色过程中存在很多步骤或环节，每一个步骤或环节都可能影响到染色的最终结果，因此，要做好一张高质量的免疫组化切片并不是一件非常容易的事。需要病理技术员和病理医生密切配合、相互协调、共同努力才能保证做出合格的免疫组化切片。,一、影响免疫组化染色质量的因素,1、标本的固定 手术标本的及时固定是保证免疫组化染色质量的关键。未能及时固定的组织，会造成细胞的变性和自溶，导致结构的破坏和抗原物质的弥散，在免疫组化染色上表现为抗原定位的变化和背景染色的增高。 过度的固定会造成抗原决定簇的封闭和抗原的丢失。,同一病例的ER表达情况,ER,ER,固定不及时,固定二周后取材,固定8小时后取材,未及时固定的乳腺癌组织ER表达胞浆着色,影响免疫组化染色质量的因素,2、切片质量的影响 切片太厚、皱褶，刀痕，敷贴不牢固，以及脱蜡不彻底，均会影响免疫组化的染色质量，易出现非特异性染色和染色不均匀。,影响免疫组化染色质量的因素,3、抗原修复环节的影响 抗原修复环节在免疫组化染色中是极为重要的环节。不同的修复时间、不同的修复方法、不同的抗原修复液，最终的结果会有差异。,同一蜡块不同修复方式的结果,ER,Her-2(2+),Her-2(1+),微波修复,水浴修复,同一蜡块不同修复时间的结果,同一蜡块使用不同修复液的结果Ki-67,EDTA,柠檬酸,4、操作过程中细节问题的影响 滴加抗体未完全覆盖组织，PBS残留过多，操作过程中切片干燥等原因，会出现边缘效应和染色不均匀及北京染色等。,抗体覆盖组织不完全造成的边缘效应,抗体覆盖不均匀的灶状着色,影响免疫组化染色质量的因素,5、第一抗体、检测系统的影响 使用不同克隆、不同种属来源的抗体，不同的检测系统，免疫组化的染色会产生差异。 使用三步法试剂盒（如SP法）生物素系统进行免疫组化染色时，如果操作不当会产生较强的背景染色。,影响免疫组化染色质量的因素,6、显色剂、复染剂的影响 不同的DAB显色试剂盒、不同的显色时间，会对免疫组化染色强度及级别判断产生影响。 苏木素复染过深、过浅，对比都不清晰。,DAB显色恰当,GST-,DAB显色恰当,CK5/6,Ki-67,胸腔积液离心包埋细胞块的免疫组化染色,TTF-1,CK7,Calponin,TOPO,CK5/6,P63,DAB显色适当，苏木素复染过浅,二、免疫组化染色的质量控制,组织固定 1、标本在离体后应立即浸泡于相当于标本体积810倍的标准固定液中，大标本要剖开固定。离体后标本固定前存放不得超过30分钟。 2、在实际工作中，就可操作性而言，10%的缓冲福尔马林是兼顾保存组织形态和抗原性通行的、被广泛接受的选择。 3、适度、适时的固定。一般而言，大标本只要做到及时切开固定，在室温下12小时即可达到固定要求；为了适应免疫组化染色标准化的需要，标本固定后应及时取材，通常固定时间不得超过24小时。 4、达到固定时间要求而不能及时进入脱水程序的标本，建议将标本置入70%的乙醇中进行暂时保存直至进入组织脱水程序。,免疫组化染色的质量控制,脱水及制片 1、建立严格的组织脱水试剂规范化更换制度，保证组织处理质量。 2、切片厚度一般34m，厚薄均匀、平整，无刀痕、折叠，采用高质量防脱载玻片。 3、切片在60烤箱内烤23小时，或者70 烤箱内1小时。 4、脱蜡要和常规切片分开，使用单独的二甲苯，如果温度过低或二甲苯使用次数较多，可适当延长脱蜡时间。,免疫组化染色的质量控制,抗原修复 抗原修复的方式有多种，热修复一般推荐高压锅热修复法，但是微波修复也有其方便的一面。影响抗原修复的基本因素是加热的温度和加热的时间，以及所使用的修复液的PH值。需要操作者在实际工作中摸索总结，同时要根据每种抗体的具体要求，找到较适合的修复方式。抗原修复的恰当与否，直接关系到免疫组织化学染色的成败，进一步影响最后结果的正确判读。,免疫组化染色的质量控制,抗体及检测系统的选择 选择优良的抗体和检测试剂盒，新买抗体要进行敏感性测试，找到最佳的抗原修复条件，每次试验要设置相应的阳性和阴性对照。 试剂的使用一定在其有效期内，同时经常观察抗体使用过程中的结果变化，如不理想要及时更换。,免疫组化染色的质量控制,显色和复染 不要忽视显色过程，和常规染色类似，显色不恰当也会造成染色的前功尽弃。不同的组织、不同的抗体显色时间有差异，必要时使用显微镜观察切片的显色效果。 苏木素复染过深过浅都会造成对比不清晰，不利于观察评价。,免疫组化染色的质量控制,影响免疫组化染色的因素很多。在操作中应注